Вестн. Моск. Ун-та. Сер. Химия. 2007. Т. 48. №1 в последнее время в медицине активно использу



Pdf көрінісі
Дата25.07.2018
өлшемі86.36 Kb.
#80352

3

ВЕСТН. МОСК. УН-ТА. СЕР. 2. ХИМИЯ. 2007. Т. 48. № 1

В последнее время в медицине активно использу-

ют новые технологии лечения заболеваний позвоноч-

ника, например термопластику межпозвонкового дис-

ка [1]. Для успешного применения данной методики

очень важно изучить процессы, протекающие в со-

единительных тканях межпозвонкового диска при

лазерном нагреве. Межпозвонковый диск состоит из

фиброзного кольца (AF) и пульпозного ядра (NP).

Их основным структурным компонентом является

фибриллярный белок коллаген, погруженный в гель

протеогликанов [2].

Проблема термостабильности коллагена иссле-

дуется давно. В работах [3–4] рассматривались

системы коллаген–вода с разным содержанием

обеих составляющих, а также интактный коллаген.

Было отмечено, что для системы тропоколлаген–

вода (10–98%) и для интактного коллагена различ-

ной степени влажности температура денатурации

увеличивается с уменьшением процентного содер-

жания воды, а для интактного коллагена теплота

денатурации не зависит от скорости нагрева. В ра-

боте [5] приведены количественные характеристики

перехода, там же приведены данные, показываю-

щие взаимосвязь между энтальпией денатурации

коллагена 

?H



m

, температурой денатурации T



m

  и


степенью его гидратированности. При увеличении

содержания воды тепловой эффект денатурации

возрастает. Так, при содержании воды от 0,07 до

1 моль энтальпия денатурации коллагена составля-

ет 11,6 Дж/г сухого образца, а при содержании

воды от 30 до 460 моль эта величина возрастает

до 58,55 Дж/г сухого образца.

Денатурация коллагена представляет собой фазо-

вый переход первого рода [6]. Для коллагена харак-

терно наличие двух фаз (кристаллической и аморф-

ной), что подтверждено рентгеноструктурным анали-

зом. В процессе денатурации в равновесных услови-

ях сохраняются постоянными объем и температура

системы, что является отличительной особенностью

фазовых переходов первого рода. Для коллагена это

условие выполняется  в случае очень медленной кри-

сталлизации или очень медленного плавления белка, а

также при совокупности этих условий. Последние сле-

ды кристалличности всегда исчезают при строго опре-

деленной температуре, поскольку плавление полимеров

происходит в небольшом интервале температур. В

работе [6] отмечено, что фибриллярное натяжение

влияет на стабилизацию структуры коллагеновых во-

локон и повышает температуру денатурации коллагена,

т.е. улучшает его термостабильность.

Авторами [7] были проведены исследования по-

ведения при термической обработке как целостной

системы, включающей в себя части позвонков и

межпозвонковый диск, так и вырезанных фрагмен-

тов тканей фиброзного кольца. Было установлено,

что при нагревании в водной среде обоих объектов

до 85°С денатурации коллагена в системе позвон-

ки–межпозвонковый диск не происходит, а коллаген

в вырезанном образце ткани фиброзного кольца под-

вергается полной денатурации. Таким образом, це-

лостность системы позвоночника влияет на термо-

стабильность коллагена. Натяжение фибрилл, имею-

щее место в целостной системе позвонки–межпоз-

вонковый диск и полностью отсутствующее в выре-

занном фрагменте ткани фиброзного кольца, вызы-

вает увеличение температуры денатурации. Воз-

можно и другое объяснение – влияние протеоглика-

нов, стабилизирующих матрикс. Однако термичес-

УДК 547.962.9; 536.628.3



ТЕРМИЧЕСКАЯ СТАБИЛЬНОСТЬ КОЛЛАГЕНА В ТКАНЯХ

МЕЖПОЗВОНКОВОГО ДИСКА

И.В. Андреева, Н.Ю. Игнатьева, С.В. Аверкиев, В.В. Лунин, О.Л. Захаркина,

М.В. Обрезкова

(кафедра физической химии; e-mail: andreeva@kge.msu.ru)

Методом дифференциальной сканирующей калориметрии  проведены исследования терми-

ческой стабильности коллагена в тканях межпозвонкового диска. Обнаружено, что при нару-

шении целостности структуры фиброзного кольца и пульпозного ядра плавление коллагена в

нативной ткани полностью протекает при температуре 62–75

°°°°°С (?????H  = 62,4Дж/г). При нагре-



вании целостной структуры вплоть до 80

°°°°°денатурация коллагена не происходит. Показано, что



разрушение протеогликановой компоненты в исследуемых тканях не влияет на термостабиль-

ность коллагена.

2 ВМУ, химия, № 1



4

ВЕСТН. МОСК. УН-ТА. СЕР. 2. ХИМИЯ. 2007. Т. 48. № 1

кое поведение протеогликановой компоненты тканей

не вполне изучено.

Данная работа посвящена изучению влияния глико-

зоаминогликанов (ГАГ) и протеогликанов на терми-

ческую стабильность коллагена в тканях фиброзного

кольца и пульпозного ядра межпозвонкового диска.



Материалы и методы

Приготовление образцов

Межпозвонковые диски и образцы тканей фиброз-

ного кольца и пульпозного ядра межпозвонкового дис-

ка вырезали (не позже 5 ч post mortem) из хвостов

телят возраста не старше 12 мес. Сегменты (высо-

та 1 см, диаметр 1–2 см) позвоночника, содержащие

межпозвонковый диск, механически отделяли от свя-

зок и мышечной ткани. Образцы тканей фиброзного

кольца и пульпозного ядра извлекали также механи-

ческим способом. Внешне структура тканей выгляде-

ла однородной и не носила повреждений. Исследова-

ние целых межпозвонковых дисков проводили сразу

после их изъятия. Часть образцов тканей фиброзного

кольца и пульпозного ядра после извлечения высуши-

вали при комнатной температуре и хранили при тем-

пературе –20°С. Подобные условия хранения не вы-

зывают изменения структуры и не оказывают воз-

действия на термические свойства тканей [8]. Для

изучения изолированной ткани фиброзного кольца и

пульпозного ядра межпозвонкового диска использова-

ли фрагменты тканей размером 3 3 1 мм. Перед

исследованием методом дифференциальной сканирую-

щей калориметрии все образцы для набухания выдер-

живали в 0,15 M NaCl.



Определение содержания коллагена

Для проведения анализа на коллаген образцы гид-

ролизовали в течение 1 ч смесью концентрирован-

ной соляной (12 М) и фторуксусной кислоты (99

вес.%) в объемном соотношении 2:1, раствор упари-

вали в концентраторе “LABCONCO”. Для определе-

ния аминокислотного состава гидролизата использо-

вали аминокислотный анализатор (“Hitachi-835”,

Japan), при этом предварительно проводили катионо-

обменное разделение и спектрофотометрическую ре-

акцию с нингидрином в соответствии со стандарт-

ной методикой [9]. Содержание коллагена определя-

ли по количеству коллагенспецифичной аминокисло-

ты гидроксипролин (Hyp), составляющей 13,3% от

массы молекулы коллагена [10].

Для определения содержания гидроксипролина в

тканях пульпозного ядра после ферментативной обра-

ботки использовали спектрофотометрическую реак-

цию с п-диметиламинобензальдегидом после предва-

рительного селективного окисления гидроксипролина

хлорамином в упаренном  гидролизате [11].

Определение содержания гликозоаминогликанов

в образцах

Содеражание ГАГ определяли по спектрофото-

метрической реакции с диметилметиленовым си-

ним по методике [12]. Сухие образцы массой от

3 до 10 мг переводили в раствор с помощью па-

паина (2,9 МЕ/мг, 2,4 мг/мл) в инкубационном бу-

фере (25 мМ/л ЭДТА, 200 мкг/мл стрептомицина,

200 ед/мл пенициллина, 0,15 М NaCl на 1 л ра-

створа) в течение 4 ч при 60°С. В измерительную

спектрофотометрическую кювету помещали аликво-

ту (50–100 мкл) изучаемого раствора и 2,5 мл ра-

створа диметилметиленового синего с концентрацией

16 мг/л (“Basic Blue 24”, “Sigma”, Германия). Оп-

тическую плотность растворов измеряли на спектро-

фотометре  “Varian Cary 3E” при длине волны

540 нм по сравнению с раствором диметилметиле-

нового синего. Калибровку проводили по растворам

хондроитинсульфата А (“Sigma”, США) с концент-

рацией от 500 до 125 мкг/мл.

Ферментативная обработка тканей

Образцы тканей фиброзного кольца и пульпозного

ядра обрабатывали 1,5 мл раствора фермента в те-

чение суток при 37°С. Использовали растворы фер-

ментов трипсина (“Sigma”, США) с концентрацией

1мг/мл и АВС хондроитиназы (“Sigma”, США) с

концентрацией 0,2 МЕ/мл в инкубационном буфере.

Термическая обработка

Сегменты позвоночника, содержащие межпозвонко-

вый диск, помещали в предварительно нагретый до

80°С 0,15 М раствор NaCl, где их выдерживали в те-

чение 15 мин. По окончании термического воздей-

ствия из межпозвонковых дисков механически извле-

кали образцы тканей фиброзного кольца и пульпозно-

го ядра.


Дифференциальная сканирующая калориметрия

(ДСК)

Термическое поведение образцов исследовали на

дифференциальном сканирующем калориметре (“DSC

822

e

, Mettler toledo”, Швейцария). Образцы массой

5–10 мг герметично закрывали в стандартных алю-

миниевых чашках (40 мл). В качестве образца срав-

нения использовали аналогичную пустую чашку. На-

грев проводили от 25 до 100°С. Скорость нагрева со-

ставляла 10 град/мин. Тепловой эффект пересчитыва-

ли на содержание коллагена.


5

ВЕСТН. МОСК. УН-ТА. СЕР. 2. ХИМИЯ. 2007. Т. 48. № 1



Результаты и обсуждение

Биохимический анализ

Данные по содержанию коллагена и гликозоамино-

гликанов, полученные для интактных образцов, а так-

же образцов, подвергнутых ферментативной обработ-

ке, представлены в табл. 1.

Данные по содержанию основных компонентов в

тканях межпозвонкового диска, полученные для

интактных образцов, хорошо согласуются с литера-

турными [2]. Отношение Hyp/Hyl позволяет выя-

вить тип коллагена ткани. Для коллагена I эта ве-

личина составляет от 14 до 22, а для коллагена

II – от 4,2 до 6. Полученные результаты позволя-

ют утверждать, что ткани пульпозного ядра содер-

жат преимущественно коллаген типа II, а ткани

фиброзного кольца – коллаген типов I и II [13].

Это согласуется с результатами иммунохимическо-

го анализа [14].

Трипсин является эндогенным протеолитическим

ферментом, катализирующим гидролиз пептидных

связей, содержащих остатки лизина и аргинина. Фер-

ментативная обработка трипсином вызывает дефраг-

ментацию протеогликанов путем разрушения их

стержневого белка и способствует переведению в

раствор отдельных олигопепетидов с прикрепленны-

ми к ним гликозоаминогликанами [15].

АВС хондроитиназа является специфическим фер-

ментом, расщепляющим 4- и 6-ходндроитинсульфат, а

также дерматансульфат. Именно таким действием

ферментов объясняется резкое уменьшение содержа-

ния хондроитинсульфата в тканях фиброзного кольца

и пульпозного ядра межпозвонкового диска после

 об-

работки их трипсином и АВС хондроитиназой.



Термическое поведение тканей AF и NP

На рис. 1, 2 приведены термограммы, для интакт-

ных, а также подвергнутых ферментативной обработ-

ке образцов фиброзного кольца и пульпозного ядра

межпозвонкового диска. Тепловые эффекты и харак-

терные значения температуры приведены в табл. 2.

Тепловой эффект (

?Н) близок к энтальпии ?Н



m

плавления коллагена. При повторном нагреве на тер-

мограммах отсутствуют какие-либо эффекты. Для

примера приведена термограмма повторного нагрева

для образца нативной ткани пульпозного ядра (рис. 1,

кривая 4). После прогрева в ячейке калориметра все

образцы полностью растворяются в трипсине, не

затрагивающем неповрежденные коллагеновые фиб-

риллы, а действущем только на деструктурированные

полипептидные цепи коллагена [8]. Все перечисленные

факты подтверждают, что при тепловом воздействии

на фрагменты тканей межпозвонкового диска проис-

ходит полная денатурация коллагена.

Т а б л и ц а  1

Биохимический состав интактных и подвергнутых ферментативной обработке тканей

фиброзного кольца и пульпозного ядра межпозвонкового диска

3 ВМУ, химия, № 1

Ткань Вид 

обработки 

Количество Hyp 

на сухой 

остаток 

(мг/100мг) 

Отношение 

Hyp/Hyl 


Содержание хондротинсульфата 

относительно массы сухого 

образца (%) 

интактный

образец 

9,6


±0,5 8,7±1

10,28±1,46 

хондротин 

АВС лиаза 

8,5

9,6


±1

5,19±0,66 

Фиброзное 

кольцо (AF) 

трипсин 

9,0


±0,5 6,6±1

5,81±4,70 

интактный

образец 


4,5

±0,5 5,8±0,5

39,97±1,17 

хондротин 

АВС лиаза 

9,0


±0,5

– 8,24±0,34 

Пульпозное 

ядро (NP) 

трипсин 

7,1


±0,5

– 8,16±0,59 



6

ВЕСТН. МОСК. УН-ТА. СЕР. 2. ХИМИЯ. 2007. Т. 48. № 1

Различие в тепловых эффектах денатурации колла-

гена для фиброзного кольца и пульпозного ядра, воз-

можно, связано с разной стабильностью коллагена в

этих тканях. Стабильность коллагена в свою оче-

редь определяется разной степенью организованности

матрикса [16]. В пульпозном ядре степень агрегации

протеогликанов мала, поэтому коллагеновая и проте-

огликановая компоненты взаимосвязаны слабо. В

фиброзном кольце протеогликаны образуют агрегаты

с гилауроновой кислотой, и степень взаимодействия

двух подстистем оказывается гораздо сильнее [2].

Подтверждением этого факта служит меньшая чув-

ствительность характеристик плавления коллагена

(Т

п

 и 


?Н

m

) в пульпозном ядре к обработке АВС хон-

дроитиназой, разрушающей гликозоаминогликаны про-

теогликановой компоненты.

Трипсин также способствует удалению из тканей

стабилизирующей протеогликановой компоненты. Од-

нако при этом ДСК показывает значительное умень-

шение теплового эффекта денатурации коллагена. По-

видимому, трипсин модифицирует коллагеновую сеть,

что и вызывает столь существенное изменение теп-

лового эффекта по сравнению с нативными образца-

ми тканей фиброзного кольца и пульпозного ядра

межпозвонкового диска. Особенно сильно тепловой

эффект снижается для тканей фиброзного кольца

межпозвонкового диска. Возможно, в этом случае

фибриллярная сеть коллагена имеет очень высокую

организацию [2], и ферментативная обработка трипси-

ном приводит к значительному ее изменению.

Общим для всех образцов тканей фиброзного

кольца и пульпозного ядра межпозвонкового диска

(как интактных, так и подвергнутых ферментативной

обработке) является то, что при тепловом воздей-

ствии на изолированные фрагменты этих тканей про-

исходит полная денатурация содержащегося в них

коллагена.

Исследование влияние термообработки на целые

межпозвонковые диски

При обработке трипсином тканей фиброзного

кольца и пульпозного ядра после термообработки

целого межпозвонкового диска наблюдалось их дис-

пергирование в растворе фермента. Однако данные

термического анализа показывают, что макромоле-

кулы коллагена сохраняют структуру тройной спира-

Рис. 1. Типичные термограммы тканей пульпозного ядра: 1 –

интактный образец, 2 – обработка ABC хондроитиназой, 3 –

обработка трипсином, 4 – термограмма повторного нагрева

интактного образца

Рис. 2. Типичные термограммы тканей фиброзного кольца: 1 –

интактный образец, 2 – интактный, 3 – образцы, подвергнутые

ферментативной обработке

Т а б л и ц а  2

Характеристики перехода в интактных и подвергнутых

ферментативной обработке тканях фиброзного кольца и

пульпозного ядра

Образец Температура 

пика 

Т

п

,



°С

Тепловой эффект 

денатурации 

коллагена  Н



m

,

Дж/г



1(NP)                     

интактный

68,44 62,4 

2(NP)                             

ABC хондроитиназа 

67,27 61,5 

3(NP)                           

Трипсин 


65,09 53,6 

4(AF)                         

интактный

68,7 57,5 

5(AF)                             

ABC хондроитиназа 

65,5 55,2 

6(AF)                          

Трипсин 

65,7 32,1 



7

ВЕСТН. МОСК. УН-ТА. СЕР. 2. ХИМИЯ. 2007. Т. 48. № 1

Рис. 3. Термограммы фиброзного кольца: 1 – подвергнутого

термообработке, 2 – в виде дисперсии

ли. На рис. 3 приведены термограммы образцов

фиброзного кольца после термообработки и термо-

граммы дисперсий этих тканей, полученных после

ферментативной обработки трипсином. Тепловые

эффекты и значения температуры пиков для них

практически полностью совпадают с теми же пока-

зателями образцов нативных тканей фиброзного

кольца. Так, тепловой эффект денатурации коллагена

фиброзного кольца после термообработки составля-

ет 20,92 Дж/г. Для дисперсии тепловой эффект дена-

турации коллагена равен 16,21 Дж/г, но эти данные

получены для сырого образца. Отметим ту же тен-

денцию уменьшения теплового эффекта денатурации

коллагена после обработки трипсином, что и была

ранее обнаружена для фрагментов тканей фиброзного

кольца, обработанных тем же ферментом.

Однако для коллагена пульпозного ядра тепловые

эффекты существенно меньше, чем для интакнтых

образцов. Тепловой эффект денатурации для колла-

гена пульпозного ядра, подвергнутого термообра-

ботке, составляет 19,62 Дж/г, а для дисперсии зна-

чение теплого эффекта денатурации коллагена равно

2,8 Дж/г. Данные по дисперсии ткани пульпозного

ядра приведены также для сырого образца. Термо-

граммы для тканей пульпозного ядра представлены

на рис. 4.

Такое значительное отличие в термическом пове-

дении между тканями целостной системы межпоз-

вонкового диска и изолированными частями фиброз-

ного кольца и пульпозного ядра может быть объясне-

но тем, что в целом межпозвонковом диске сохраня-

ется натяжение фибриллярной коллагеновой сети, по-

этому даже при нагреве тканей до 80°С и выдержи-

вании их при этой температуре достаточно длительно

время денатурации коллагена не происходит. Дей-

ствительно, приложение силы натяжения в направле-

нии главной оси коллагеновго волокна с увеличением

нагрузки вызывает рост температуры плавления кол-

лагена. Например, при силе натяжения (р), соответ-

ствующей 2 атм, плавление происходит при 65°С, а

при р = 8,8 атм температура плавления (Т

пл

) возрас-



тает до 80°С [6]. Аналогичный результат представ-

лен в работе [17], где показано, что при постоянной

температуре возможность денатурации зависит от

величины нагрузки, приложенной к изучаемому образ-

цу. Так, при 67°С в образцах тканей связок при р

?

6 атм денатурации не происходит, тогда как при р



?

1,92 атм коллаген полностью денатурирует. В пуль-

позном ядре фибриллярная коллагеновая сеть значи-

тельно менее ярко выражена, отсутствует жесткая

структура ткани, часть коллагена при нагревании де-

натурирует, что и объясняет уменьшение теплового

эффекта денатурации при последующем нагревании в

ячейке ДСК-калориметра.

В целом проведенные исследования показывают,

что гликозоаминогликаны мало влияют на термоста-

бильность коллагена, поскольку тепловой эффект де-

натурации образцов, обработанных АВС хондроитина-

зой, незначительно отличается от теплового эффекта

интактных образцов. При этом ферментативная обра-

ботка трипсином, по-видимому, вызывает модифика-

цию самой коллагеновой сети, поскольку тепловой

эффект для таких образцов значительно ниже, чем

для нативных тканей.

Из проведенного анализа видно, что на тепловой

эффект денатурации коллагена в фиброзном кольце и

пульпозном ядре межпозвонкового диска значитель-

ное влияние оказывает целостность фибриллярной

структуры коллагеновых сетей. При термическом

Рис. 4. Термограммы пульпозного ядра: 1 – подвергнутого

термообработке, 2 – в виде дисперсии

4 ВМУ, химия, № 1



8

ВЕСТН. МОСК. УН-ТА. СЕР. 2. ХИМИЯ. 2007. Т. 48. № 1



THE THERMAL STABILITY OF COLLAGEN IN TISSUES

OF INTERVERTEBRAL DISK

I.V. Andreyeva, N.Yu. Ignat’eva, S.V. Averkiev, V.V. Lunin, O.L. Zakharkina,

M.V. Obrezkova

(Division of Physical Chemistry)

The thermal collagen stability of intervertebral disc was investigated by differential scanning

calorimetry (DSC). It was found that the melting of collagen occurred completely at 62–75°С (

?????H ~



60 J

?????g



–1

) under heating excised samples of annulus fibrosus and nucleus pulposus. After heating

intact intervertebral disc until 80°С denaturation of collagen was not observed. It was shown that the

destruction of proteoglycans in examined tissues has not affect on the collagen stability.

воздействии коллаген таких тканей, где сохраняется

фибриллярная сеть, денатурации не подвергается,

тогда как коллаген фрагментов тканей фиброзного

кольца и пульпозного ядра свободно денатурирует

при нагревании. Коллагеновые фибриллы концентри-

чески распространены по всему диску, что вызывает

большую устойчивость всей системы в целом ко

внешнему тепловому воздействию. Однако проведен-

ные исследования показывают, что при термообра-

ботке целого межпозвонкового диска происходит раз-

рушение компонентов, связывающих коллагеновую

сеть, что подтверждается диспергированием тканей,

подвергнутых термообработке,  при воздействии на

них трипсина.

Авторы благодарят РФФИ (гранты 02-04-16743, 02-05-16902а) и CRDF (грант RUP2-2660-MO-05) за

поддержку данной работы.

9. Tsugita A., Scheffler J. // Eur. J. Biochem. 1982. 124. P. 585.

10. Gasteiger E., Gattiker A., Hoogland C., Ivanyi I., Appel R.D.,

Bairoch A. // Nucleic Acids Res. 2003. 31. P. 3784.

11. Woessner J.F. // Arch. Biochem. Biophys. 1961. 93. P. 440.

12. Farhdale R.W., Buttle D.J. // Biochim. Biophys. Acta. 1986.

883. P. 173.

13. Blumenkrantz N., Sylvest J., Asboe-Hansen G. // Biochem.

Med. 1977. 18. N 3. P. 283.

14. Hollander A.P., Heathfield T.F., Liu J.J., Pidoux I., Roughley



P.J., Mort J.S., Poole A.R. // J. Orthop. Res. 1996. 14. P. 61.

15. Игнатьева Н.Ю., Соболь Э.Н., Аверкиев С.В., Лунин В. В.,



Гороховская Т.Е., Баграташвили В.Н., Янцен Е.С. //

ДАН. 2004. 395.  C. 696.

16. Игнатьева Н. Ю., Аверкиев С. В., Соболь Э. Н., Лунин В. В.

//  ЖФХ. 2005. 79. C. 1505.

17. Aksan A., McGrath J. J. // Trans. ASME. 2003. 125. P. 700.

Поступила в редакцию 28.11.05

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Kleinstueck F.S., Diederich C.J., Nau W.H., Puttlitz C.M.,

Smith J.A., Bradford D.S., Lotz J.C. // Spine. 2003. 28. P. 1700.

2. Ghosh P.  The biology of intervertebral disc. V. 1. CRC Press

Inc. Boca Raton, Florida, 2000.

3. Церетели Г.И. // Биофизика. 1982. 27. №  5. C. 780.

4. Церетели Г.И., Белопольская Т.В., Мельник Т.М. // Биофи-

зика. 1997. 42. № 1. C. 68.

5. Miles C.A., Ghelashvili M. // Biophys. J. 1999. 76.  P. 324.

6. Манделькерн Л. Кристаллизация полимеров. Химия. М.;Л.,

1966.

7. Bass E.C., Wistrom E.V., Diederich C.J., Nau W.H.,



Pellegrino R., Ruberti J., Lotz  J.C. // J.  Biomech. 2004. 37.

N 2. P. 233.



8. Bank R.A., Krikken M., Beekman B., Stoop R., Maroudas A.,

Lafeber F., TeKoppele J.M. // Matrix Biol. 1997. 16. P. 233.



Достарыңызбен бөлісу:




©stom.tilimen.org 2023
әкімшілігінің қараңыз

    Басты бет