Сохранение и модификация днк: репарация генетических повреждений



Дата16.07.2017
өлшемі446 b.
#38890


Сохранение и модификация ДНК:


Часть 1

  • Мутации и мутагены



Основные термины

  • Мутации – это явления скачкообразного, прерывистого изменения наследственного признака. (определение Г. Де Фриза)

  • Мутации – это наследуемые изменения структуры генома, т.е. изменение структуры геномных нуклеиновых кислот.

  • Мутагенез – это процесс возникновения мутаций, основанный на различных механизмах.



Мутационная теория

  • Основные положения мутационной теории Г. Де Фриза сводятся к следующему:

  • Мутации возникают внезапно, как дискретные изменения признаков.

  • Новые формы устойчивы.

  • В отличие от не наследстве иных изменений мутации не образуют непрерывных рядов, не группируются вокруг какого-либо среднего признака. Они представляют собой качественные изменения

  • Мутации проявляются по-разному и могут быть как полезными, так и вредными.

  • Вероятность обнаружения мутаций зависит от числа исследованных особей.

  • Сходные мутации могут возникать неоднократно.



Классификация мутаций

  • В зависимости от факторов, вызывающих мутации, их разделяют на спонтанные и индуцированные.

    • Спонтанные мутации возникают самопроизвольно на протяжении всей жизни организма в нормальных для него условиях окружающей среды (спонтанные мутации в эукариотических клетках возникают с частотой 10-9–10-12 на нуклеотид за клеточную генерацию).
    • Индуцированные мутации – это наследуемые изменения генома, возникающие в результате тех или иных мутагенных воздействий в искусственных (экспериментальных) условиях или при неблагоприятных воздействиях окружающей среды.


Классификация мутаций

  • В зависимости от размеров сегментов генома, подвергающихся преобразованиям, мутации разделяют на геномные, хромосомные и генные.

    • При геномных мутациях происходит внезапное изменение числа хромосом, кратное целому геному.
      • Полиплоидизация – умножение наборов хромосом, при котором происходит образование полиплоидных организмов, геном которых представлен 4n, 6n и т.д. В зависимости от происхождения хромосом в полиплоидах различают
        • Аллополиплоидию в результате которой происходит объединение при гибридизации целых неродственных геномов.
        • Аутополиплоидию для которой характерно адекватное увеличение числа хромосом собственного генома, кратное 2n.


Классификация мутаций

  • При хромосомных мутациях происходят как изменение числа отдельных хромосом в геноме (анеуплоидия), так и крупные перестройки структуры отдельных хромосом (хромосомные аберрации):

    • Делеция - потеря части генетического материала.
    • Дупликация - удвоение части генетического материала.
    • Инверсия - изменение ориентации сегментов хромосом в отдельных хромосомах.
    • Транслокация - перенос части генетического материала с одной хромосомы на другую.


Классификация мутаций

  • Генные мутации - изменения первичной структуры ДНК генов под действием мутагенных факторов (встречаются более часто, чем предыдущие два типа мутаций).

    • В результате генных мутаций происходят замены, делеции и вставки одного или нескольких нуклеотидов, транслокации, дупликации и инверсии различных частей гена.


Классификация мутаций

  • Из-за вырожденности генетического кода могут быть три генетических последствия точковых мутаций:

    • Синонимическая замена нуклеотида с сохранением смысла кодона.
    • Миссенс-мутация - изменение смысла кодона, приводящее к замене аминокислоты в соответствующем месте полипептидной цепи.
    • Нонсенс-мутация - образование бессмысленного кодона с преждевременной терминацией трансляции.


Классификация мутаций

  • По влиянию на экспрессию генов мутации разделяют на две категории:

    • Мутации замен пар оснований
    • Мутации сдвига рамки считывания (frameshift), т.е. делеции или вставки нуклеотидов, число которых не кратно трем, что связано с триплетностью генетического кода.


Классификация мутаций

  • Первичную мутацию называют прямой мутацией, а мутацию, восстанавливающую исходную структуру гена – обратной мутацией или реверсией.

    • Супрессорная мутация – когда возврат к исходному фенотипу у мутантного организма вследствие восстановления функции мутантного гена происходит не за счет истинной реверсии, а вследствие мутации в другой части того же самого гена или даже другого неаллельного гена. Генетические механизмы такой супрессии мутантного фенотипа, весьма разнообразны.


Основные источники мутаций

  • В основе мутаций на молекулярном уровне лежат две основные причины:

    • Ошибки репликации
    • Мутагенные воздействия различной природы.


Ошибки репликации

  • Точность процесса репликации определяется:

  • Различиями в свободной энергии у канонических или ошибочных пар азотистых оснований ДНК, образующихся по правилам Уотсона–Крика в водных растворах (различия порядка1–3 ккал/моль и обеспечивают точность 1 ошибка на каждые 100 нуклеотидов).

  • Наличием свойственной многим бактериальным и эукариотическим ДНК-полимеразам 3’5’-экзонуклеазной корректирующей активности (ошибочно включенные нуклеотиды, некомплементарные матрице, удаляются с 3’-конца растущей цепи ДНК перед включением следующего нуклеотида в строящуюся цепь ДНК).

  • Таким образом точность функционирования ДНК-полимераз не является абсолютной, а зависит от взаимодействия белков и ферментов системы репликации и матричной ДНК. Изменение свойств этих белков или матрицы как спонтанно, так и под действием различных модифицирующих агентов приводит к ошибкам в репликации ДНК и мутациям.



Мутагенные воздействия

  • Усилий систем репликации становится недостаточно в стрессовых ситуациях, когда организм подвергается массированному мутагенному воздействию.

  • Процесс накопления мутаций, избежавших коррекции системами репарации, является кумулятивным – к ранее существовавшим мутациям неуклонно добавляются новые, и суммарное количество мутаций в геноме (генетический груз) возрастает.

  • Процесс накопления мутаций – статистический, поэтому в настоящее время можно предсказывать лишь вероятность возникновения конкретной мутации в генетическом локусе или геноме организма.



Ионизирующее излучение

  • Ярко выраженным мутагенным действием обладают:

  • Коротковолновое электромагнитное излучение (УФ-свет, рентгеновские лучи)

  • Элементарные частицы, образующиеся в процессе радиоактивного распада вещества.

  • Механизм воздействия:

  • Электромагнитное излучение или элементарные частицы, проходя через вещество передают свою энергию атомам в процессе первичного столкновения.

  • В результате первичного столкновения из атома вещества выбиваются электроны, превращая его в положительно заряженный ион.

  • Вторично освобожденные электроны вызывают образование ионов на своем пути до тех пор, пока их энергия не понизится и они не утратят свою ионизирующую способность.



Химические мутагены

  • Многие химические соединения обладают способностью взаимодействовать с ДНК или с ее низкомолекулярными предшественниками и вызывать мутации. Химические мутагены можно разделить на две большие группы

  • “Явные мутагены” - химические соединения изначально являются реакционноспособными мутагенами, способными непосредственно взаимодействовать с ДНК и изменять ее химическую структуру.

  • “Скрытые мутагены” или промутагены – исходные химические соединения для превращения в мутагены сначала претерпевают метаболическую активацию под действием ферментативных систем организма.



Алкилирующие агенты

  • Наиболее обширным классом химических мутагенов экзогенного происхождения являются алкилирующие агенты.

  • Механизм повреждающего воздействия заключается в спонтанном (без участия ферментативных систем организма) переносе алкильных групп этих химических соединений на биологические макромолекулы, в том числе и ДНК.



Алкилирующие агенты

  • Главным источником мутаций, возникающих под действием алкилирующих агентов, является алкилирование O-6 в гуанине и O-4 в тимине ДНК.





Азотистая кислота как мутаген

  • Азотистая кислота образуется из нитритов (NaNO2 и KNO2) в водных растворах при низких значениях pH.

  • Механизм повреждающего действия заключается в дезаминировании азотистых оснований нуклеиновых кислот.

  • В результате:

  • Спаривание урацила с аденином приводит к транзициям GCAT.

  • Гипоксантин вызывает обратную транзицию ATGC.

  • Ксантин не спаривается ни с одним из пиримидинов и его включение оказывается летальным для клетки.





Органические перекиси как мутагены

  • Мутагенным действием обладают различные органические перекиси.

  • Азид натрия – мощный ингибитор дыхания, также обладает мутагенным действием, что связывают с накоплением при этом ингибировании мутагенных перекисей.

  • Механизм повреждающего действия перекисей заключается в индукции образования различных реакционноспособных радикалов – активных форм кислорода (имитируют мутагенное действие рентгеновских лучей) в результате образуются мутации и разрывы хромосом.



Активные формы кислорода

  • В клетках активные формы кислорода (АФК) возникают в реакциях восстановления, в результате которых появляются чрезвычайно реакционноспособные промежуточные соединения.

  • Наибольшую опасность для ДНК представляют радикалы гидроксила, супероксид и синглетный кислород, которые образуются в процессе дыхания, фагоцитоза и при повреждении клеток.

  • Ежедневно в каждой клетке человека возникает 10000 таких модифицированных АФК нуклеотидов.



Активные формы кислорода



Аналоги нуклеозидов и оснований

  • Аналоги нуклеозидов и оснований: 5-бромдезоксиуридин и 2-аминопурин, так же являются сильными мутагенами.

  • 5-бромдезоксиуридин обычно включается в ДНК вместо цитозина и спаривается с аденином, что приводит к образованию транзиций GCAT.

  • 2-аминопурин включается вместо аденина и спаривается с цитозином, в результате чего возникают обратные транзиции ATGC.



Интеркалирующие соединения

  • Красители нуклеиновых кислот, обладающие способностью интеркалировать между основаниями ДНК, вызывают мутации со сдвигом рамки считывания.

  • Примерами таким красителей являются широко используемые в лабораторной практике бромистый этидий и производные акридина.





Метаболическая активация проканцерогенов

  • Для защиты от накопления экзогенных чужеродных химических соединений (ксенобиотиков) у каждого живого организма имеются эффективные ферментативные механизмы.

  • Многие опасные для здоровья ксенобиотики гидрофобны и могут накапливаться в липидах клеточных мембран. Для того, чтобы их вывести из организма необходимо повысить их растворимость в воде, т.е. сделать гидрофильными.

  • Процесс метаболической инактивации ксенобиотиков и повышения их гидрофильности проходят в два этапа:

    • Ферментативное введение в их молекулы небольших полярных групп (например гидроксильных).
    • Конъюгация преобразованных молекул ксенобиотиков с еще более полярными химическими группировками, в частности с остатками глюкуроновой кислоты, сульфатов или глицина.


Цитохромы Р-450

  • В первой фазе метаболизма ксенобиотиков принимают участие цитохромы группы Р-450. Эти ферменты в организме представлены большим числом (>20) изоформ, каждая из которых, как правило, обладает широкой субстратной специфичностью.

  • Обобщенное уравнение химической реакции, осуществляемой цитохромами Р-450:

  • S + NAD(P)H + O2  SO + NAD(P)+ + H2O

  • (S – молекула субстрата, а SO – ее окисленная форма)

  • Молекулы цитохрома Р- 450 интегрированы в мембраны гладкого ЭР, которые так же содержат небольшую электронтранспортную цепь.





Эндогенные мутагены

  • Молекулы ДНК часто претерпевают in vivo тепловую депуринизацию, которая может быть спонтанным внутренним источником измененных нуклеотидов.



Эндогенные мутагены

  • Источником эндогенных мутаций служит самопроизвольное дезаминирование цитозина в составе ДНК с образованием урацила.



Эндогенные мутагены

  • Источником эндогенных мутагенов в организме является метаболизм нормальной микрофлоры. Некоторые промежуточные соединения, возникающие при метаболизме аминокислот, желчных кислот и холестерина под действием бактерий организма человека обладают мутагенной и канцерогенной активностью.

  • В результате метаболизма в бактериальных клетках происходит активация нитратов с образованием мутагенных и канцерогенных N-нитрозаминов в кишечнике, желудке и ротовой полости человека.



Часть 2



Определение

  • Репарация генетических повреждений – это свойство живых организмов восстанавливать повреждения, возникшие в ДНК в результате ошибок репликации, а так же воздействия разнообразных мутагенных факторов радиационной и химической природы.



Общие сведения

  • В настоящее время описано множество различных систем репарации, часто принципиально отличных друг от друга.

  • Простые реакции репарации происходят немедленно после мутагенного воздействия, более сложные системы требуют индукции синтеза новых ферментов и следовательно растянуты во времени.

  • Многие реакции идут до того, как клетки вступят в новую фазу деления, а другие могут осуществляться только после того, как клетка закончила деление.

  • Существуют также реакции, когда клетки "стараются" спасти свою жизнь путем введения новых мутации.



Основной принцип репарации

  • Основан на двуспиральном строении ДНК.

  • В большинстве случаев поврежденной оказывается только одна цепь ДНК, вторая же цепь сохраняется в нативном состоянии и служит матрицей, по которой осуществляется коррекция повреждения. Таким образом задача сводится к детекции повреждения и дальнейшей его коррекции либо напрямую, либо путем удаления поврежденного участка и застройкой по матрице неповрежденной цепи.

  • Существует опасность повреждения обоих цепей дуплекса, для репарации в этом случае необходимы особые ферментные системы.



Повреждения ДНК

  • Появление различно модифицированных оснований:

    • Пиримидиновые димеры.
    • Алкилированые производные.
    • Дезаминированые основания.
    • Различные таутомерные формы.
  • Появление неспаренных оснований (Mismatch) в результате рекомбинации дуплексов или ошибок в процессе репликации.

  • Повреждения структуры дуплекса:

    • Разрывы фосфодиэфирных связей сахарофосфатного остова молекулы ДНК.
    • Разрывы β-гликозидных связей между основанием и дезоксирибозой.


Основные повреждающие факторы

  • Ионизирующие агенты:

    • Ультрафиолетовый свет.
    • Радиоактивные вещества.
    • Активные формы кислорода.
  • Химические мутагены (например алкилирующие агенты).

  • Эндогенные мутагены.

  • Ошибки ферментов репликации.

  • Мутации в генах ферментов общего метаболизма ДНК и как следствие увеличение частоты ошибок при репликации.



Пиримидиновые димеры

  • Расстояние между параллельными плоскостями оснований в В-форме оказывается как раз таким, чтобы освободившиеся при УФ-облучении валентности между С5-С6 атомами пиримидиновых оснований, расположенных рядом в цепи ДНК, могли замкнуться друг на друга и сформировать циклобутановое кольцо.



Таутомерные переходы

  • Таутомерия (от греч. tautós — тот же самый и méros — доля, часть), быстрая обратимая структурная изомеризация; способные к таутомерии вещества при установившемся равновесии представляют собой смеси двух (или нескольких) взаимопревращающихся изомеров — таутомеров.

  • Цитозин и аденин имеют при ароматическом гетероцикле аминную группу, а тимин и гуанин кетонную, следовательно есть возможность аминно-иминной кето-енольной таутомерии.









Разнообразие систем репарации

  • Существует огромное количество самых различных систем репарации. Все эти системы появлялись в эволюции независимо, в различные её периоды.

  • Один тип повреждений, как правило, репарируют несколько различных ферментативных систем, взаимно дополняя друг друга.

  • К прямой репарации относят процессы в которых происходит узнавание и непосредственное восстановление какого-либо типа повреждений.

  • К непрямой репарации (опосредованной) относят процессы более универсального характера, позволяющие исправлять широкий набор повреждений с помощью мультиферментных систем.



Разнообразие систем репарации

  • Прямая репарация:

    • Фотореактивация.
    • Дезалкилирование модифицированных нуклеотидов.
    • Сшивание однонитевых разрывов.
    • Прямая вставка оснований в АП-сайт.
  • Непрямая репарация:

    • Эксцизионная репарация ДНК путем удаления поврежденных азотистых оснований (BER).
    • Эксцизионная репарация ДНК путем удаления нуклеотидов (NER).
    • Репарация ошибочно спаренных нуклеотидов (MMR).
    • Пострепликативная (рекомбинационная) репарация.
    • SOS-репарация.


Фотореактивация

  • В фотолиазе есть участок, служащий светочувствительным центром, который способен адсорбировать фотоны.



Фотореактивация

  • Система ферментативной фотореактивации ДНК (photoreactivation – PHR), основным компонентом которой является ДНК-фотолиаза, разделяет пиримидиновые димеры, превращая их в нормальные пиримидиновые основания.

  • Фотолиаза непосредственно взаимодействует с поврежденным участком ДНК.

  • Видимый свет абсолютно необходим для работы фотолиазы.



Структура фотолиазы

  • Фотолиаза содержит два кофактора: светоулавливающий метенилтетрагидрофолат (HDF) и генерирующий свободные радикалы FADH–.

  • Оба они надежно заключены внутрь белковой глобулы, которая выполняет функции поддержания свободных радикалов и селективного отбора субстратов.



Репарация алкилированных оснований

  • В клетках синтезируются белки метилтрансферазы, которые могут захватывать метильные группы от модифицированного основания и благодаря этому восстанавливать исходную структуру ДНК.

  • Важно отметить, что метилтрансфераза, захватив метильную группу, не может от нее освободиться. Тем самым в прямом смысле эти белки не ферменты, так как последние не изменяются в ходе реакций.

  • Внутри клетки метилтрансфераз накапливается несколько тысяч, чтобы обеспечить нужды репарации: по одной молекуле уходит на одно повреждение.



Сшивание однонитевых разрывов:

  • Этот тип реакций прямой репарации был обнаружен для однонитевых разрывов ДНК, индуцируемых ионизирующим излучением.

  • При этом с помощью фермента ДНК - полинуклеотидлигазы (от англ. ligase - соединять, связывать) происходит прямое воссоединение разорванных концов в молекуле ДНК.



Вставка оснований в АП-сайт

  • Ковалентная связь между основанием и сахаром (β-гликозид-ная связь) может рваться. Тогда в молекуле ДНК на месте этих оснований образуется брешь, названная АП-сайтом.

  • Описаны ферменты, названные инсертазами (от англ, insert - вставлять), которые могут вставлять в брешь такое же основание, какое было до поражения, и соединять его с дезоксирибозой.

  • Структура ДНК приобретает исходный неповрежденный вид.



Эксцизионная репарация ДНК путем удаления поврежденных азотистых оснований (BER)



Base excision repair – BER

  • Система BER обеспечивает защиту геномной ДНК от повреждений, вызываемых главным образом алкилирующими агентами, а также эндогенными генотоксическими соединениями, включая внутриклеточные радикалы кислорода и другие реакционноспособные метаболиты

  • BER начинает функционировать с отщепления ошибочно включенных или модифицированных оснований от дезоксирибозы под действием ключевого фермента – ДНК-гликозилазы, обладающего способностью отщеплять большое число модифицированных оснований ДНК



Разнообразие гликозилаз







Структура гликозилаз



Механизм работы гликозилаз

  • Механизм связывания поврежден-ного основания гликозилазой имеет много сходных моментов с меха-низмом захвата метилазами свойх субстратов.

  • Метилаза выворачивает модифици-руемое основание из цепи наружу от фосфодиэфирного остова молекулы. Это вывернутое основание входит в особую щель фермента, где располо-жен его активный центр, в котором на него переносится метильная группа.

  • Затем модифицированное основание возвращается обратно в цепь. Все описанные выше реакции не требу-ют дополнительного притока энергии.





Base excision repair – BER

  • Гликозилазы присоединяются модифицированным основаниям и гидролизуют β-N- гликозидные связи между основанием и сахаром дезоксирибозой, за счет чего образуется АП-сайт.

  • Образовавшаяся АР-дезоксирибоза далее вырезается с помощью АР-лиазы, которая освобождает ее 3’-конец, и АР-эндонуклеазы, гидролизующей ее 5’-концевую фосфодиэфирную связь в АР-сайте.



Base excision repair – BER

  • Появившаяся брешь в одной цепи ДНК размером в один нуклеотид застраивается с участием фермента ДНК - полимеразы I. Она вставляет в брешь комплементарный ему нуклеотид, присоединяя его к свободному З‘ОН-концу.

  • Для соединения одноцепочечного разрыва в фосфодиэфирном остове вступает в действие еще один фермент — ДНК-лигаза.



Эксцизионная репарация ДНК путем удаления нуклеотидов (NER)



Nucleotide excision repair – NER

  • Процесс NER условно можно разделить на четыре этапа:

  • Распознавание поврежденного участка ДНК;

  • Двойное надрезание (инцизия) цепи ДНК по обеим сторонам поврежденного участка и его удаление (эксцизия);

  • Заполнение бреши в процессе репаративного синтеза;

  • Лигирование оставшегося одноцепочечного разрыва ДНК.



Nucleotide excision repair – NER

  • В отличии от BER, субстратами системы NER являются не только поврежденные (модифицированные) основания, но и одиночные ошибочно спаренные нуклеотиды, а также петли длиной в 1–3 нуклеотида.

  • Но в отличие от системы MMR, удаляющей неправильно спаренные основания, NER не может идентифицировать, нуклеотид какой цепи ДНК оказывается правильным. В результате происходит вырезание неспаренных нуклеотидов из любой цепи случайным образом.

  • Главными участниками NER в клетках Е. соli (но не у человека) является мультиферментный комплекс, содержащий эндонуклеазы, кодируемые тремя генами: uvrА, uvrВ и uvrC (названия генов даны по первым буквам слов ultra violet repair).

  • Комплекс получил название "эксинуклеаза".



Механизм работы

  • Белковые ножницы, содержащие две копии белка UvrA и одну копию UvrB, узнают поврежденный участок и присоединяются к нему.

  • Энергия АТР используется, чтобы изогнуть молекулу ДНК и изменить конформацию белка UvrB; димер UvrA отсоединяется.



Механизм работы

  • Белок UvrC присоединяется к комплексу UvrВ – ДНК; белок UvrВ делает 3’-надрез, а UvrC вносит 5’-надрез вблизи повреждения.

  • UvrD хеликаза отсоединяет вырезанный олигомер.

  • ДНК-полимераза I замещает UvrВ белок и застраивает образовавшуюся брешь, комплементарно противоположной нити.

  • ДНК лигаза соединяет свободные концы, оставленные полимеразой.









Различия NER у про- и эукариот

  • Гены NER у E. coli uvrA, uvrB и uvrC не обнаруживают гомологии с соответствующими генами млекопитающих и дрожжей.

  • В универсальном механизме эксцизионной репарации как прокариоты, так и эукариоты гидролизуют 3–5-ю фосфодиэфирную связь с 3'-конца от повреждения. При этом прокариоты гидролизуют также 8-ю связь от 5’-конца измененного нуклеотида, тогда как у эукариотических организмов происходит одноцепочечный разрыв на расстоянии 21–25 нуклеотидов от повреждения со стороны его 5’-конца. Таким образом, прокариоты удаляют измененный нуклеотид в составе 12–13-членных олигомеров, тогда как эукариоты – в составе одноцепочечных фрагментов ДНК длиной в 27–29 нуклеотидов.

  • Млекопитающим требуется в среднем в четыре раза больше ферментов репарации, чем бактериям (эксинуклеаза состоит по крайней мере из 17 белков).

  • Подавление NER ведет к резкому увеличению числа мутаций хромосом, замедлению роста и развития организмов, и к другим нежелательным последствиям.



Репарация ошибочно спаренных нуклеотидов (MMR)



Mismatch repair - MMR

  • В отличие от NER, так же удаляющей неправильно спаренные основания, MMR может идентифицировать нуклеотид какой цепи ДНК является правильным (способна обнаруживать матрицу для репарации).

  • Субстратами системы MMR у E. coli, использующей белки MutHLS являются все некомплементарные пары оснований за исключением C–C, а также небольшие вставки в одну из цепей ДНК, длина которых не превышает четырех нуклеотидов.

  • Система MMR выполняет в клетке несколько важных функций:

  • Исправляет ошибки репликации ДНК, меняя ошибочно включенные нуклеотиды.

  • Обеспечивает гомологичную рекомбинацию между дивергировавшими последовательностями ДНК, посредством процессинга промежуточных продуктов рекомбинации.

  • Обеспечивает задержку клеточного цикла в ответ на повреждения ДНК.



Метилирование матричных цепей

  • Обычно у E. coli ДНК метилирована Dam-метилазой по сайтам GATC. После завершения репликации вновь синтезированная дочерняя цепь ДНК некоторое время остается неметилированной. Система MutHLS избирательно репарирует дочернюю цепь ДНК, тем самым значительно повышая точность репликации.

  • Если сайты GATC полностью метилированы, MutHLS-система репарации E. coli изменяет ошибочно спаренные нуклеотиды в обеих цепях ДНК с одинаковой эффективностью.

  • Использование Dam-метилазы для распознования дочерней цепи реплицировавшейся ДНК является уникальным свойством грамотрицательных бактерий. У грамположительных бактерий не происходит метилирование цепей ДНК в целях маркировки.



Механизм работы

  • На начальных этапах система MMR задействует белковые продукты четырех генов: mutH, mutL, mutS и uvrD (mutU):

  • Белок MutS распознает повреждение и связывается с ошибочно спаренными нуклеотидами в виде гомодимера.

  • С каждым мономером MutS связывается белок МutL, не обнаруживающий ферментативной активности, но абсолютно необходимый для присоединения и активации другого белка – МutH.

  • Белок MutH – эндонуклеаза, способная находить участок GATC и предпочтительно вносить одноцепочечный разрыв в неметилированную цепь вблизи аденина последовательности GATC.



Механизм работы

  • После полной сборки комплекса MutHLS, активации эндонуклеазной активности MutH и внесения разрывов в GATC-сайты дочерней цепи, происходит экзонуклеазное выщепление участка поврежденной цепи от первичного разрыва до мисмэтча.

  • Надрезы могут быть внесены как с 5'-, так и с 3'-стороны относительно неправильно включенного в дочернюю цепь нуклеотида.

  • Затем в обоих случаях бреши должны быть застроены ДНК-полимеразой, а концы воссоединены с помощью ДНК-лигазы.



Другие системы

  • У E. coli существуют два других специфических пути репарации ошибочно спаренных нуклеотидов:

  • Система VSP (very short patch repair pathway) репарирует некомплементарные пары G–T, заменяя их на G–C. Считается, что такие пары образуются в результате дезаминирования 5-метилцитозина в сайтах, где остатки С метилированы Dcm-метилазой.

  • MutY-система репарации специфически ликвидирует последствия окислительных повреждений гуанина. Если dGTP окисляется с образованием 8-оксо-dGTP и остается в составе ДНК неотрепарирован-ным, в следующем раунде репликации он спаривается с А, и в итоге может произойти трансверсия G–CT–A. В этом случае белок MutY действует как ДНК-гликозилаза, удаляющая остаток A из некорректной пары, и как AP-лиаза, вносящая одноцепочечный разрыв по соседству с AP-сайтом.









Пострепликативная (рекомбинационная) репарация



Рекомбинационная репарация

  • Быстро делящиеся бактериальные клетки, содержащие несколько репликонов, образованных недореплицированными хромосомами, более устойчивы к действию ионизирующей радиации, которая индуцирует двухцепочечные разрывы ДНК, чем клетки с небольшим числом репликонов, находящиеся в стационарной фазе.

  • Это может объяснятся тем, что для эффективного исправления повреждений, вызываемых ионизирующей радиацией, необходимо одновременное присутствие в клетке двух гомологичных молекул ДНК.



Рекомбинационная репарация

  • Рекомбинационная репарация необходима в случае, когда повреждены обе цепи ДНК, что может быть результатом:



Рекомбинационная репарация

  • Второй дуплекс ДНК, полученный в результате репликации, не содержит в себе разрывов или модифицированных оснований.

  • Поврежденный дуплекс является гомологичным к ДНК второго дуплекса, не содержащего повреждений.

  • Таким образом для репарации необходимо осуществить одноцепо-чечный обмен между неповрежденным донорным дуплексом и разорванным акцепторным. В результате брешь в поврежденном дуплексе будет заполнена последовательностью из донорного дуплекса, а поврежденное основание будет репарировано.



Механизм процесса

  • Главный этап рекомбинационной репарации заключается в активации генов rec, участвующих так же и в процессе гомологичной рекомбинации.

  • Процесс репарации условно разделяют на три фазы:

  • В пресинаптической фазе репарации происходит внесение двухцепочечного разрыва в ДНК и осуществляется нуклеазное расщепление концов разрыва. В создании одноцепочечных 3’-OH-выступающих концов ДНК в месте разрыва принимает участие белок RecBCD, который обладает как хеликазной, так и экзонуклеазной активностями. RecBCD расплетает двухцепочечную молекулу ДНК в месте разрыва и гидролизует одну из цепей в направлении 5’3’, оставляя выступающий одноцепочечный участок.



Механизм процесса

  • В синаптической фазе наблюдается синапсис гомологичных участков двух молекул ДНК с вхождением комплементарного одноцепочечного участка в ДНК-дуплекс и последующим репаративным синтезом ДНК. Поиск гомологичных участков и обмен цепями, необходимые для рекомбинации, происходят с участием белка RecA.

  • В постсинаптической фазе репарации образовавшиеся структуры Холидея разделяются с помощью белков RuvA, -B и -C, RecG, а также белков SOS-системы репарации (RecN, UvrD, RecF и RecJ).

  • Многие продукты генов E. coli и дрожжей, участвующие в рекомбинационной репарации повреждений ДНК, имеют гомологи у животных и человека.



Рекомбинационная репарация



Часть 3

  • SOS-репарация и SOS-мутагенез



SOS-репарация

  • В клетках организма, подвергнутого сильному мутагенному воздействию, образование мутаций происходит в основном по механизму SOS-мутагенеза.

  • SOS-мутагенез дает возможность микроорганизмам преодолевать летальное действие повреждений ДНК, которые блокируют репликацию ДНК и с которыми не справляется обычная репаративная система (например одноцепочечные бреши, в которых сохранившаяся цепь не содержит азотистых оснований).

  • Основной принцип SOS-репарации заключается в преднамеренном введении ошибок ДНК-полимеразами в процессе репликации на последовательностях, содержащих различные повреждения.

  • В индукции SOS-репарации у E. coli определяющую роль играют два гена: lexA и recA.



Индукция SOS-репарации

  • Белок LexA является репрессором гена recA и более 20 других генов и оперонов, составляющих SOS-регулон.

  • В ответ на повреждение ДНК или ингибирование репликации, при остановке ДНК-полимеразы на поврежденном участке ДНК, вырабатывается внутриклеточный SOS-сигнал.

  • В результате индукции SOS-сигнала белок recA связывается с одноцепочечными участками ДНК содержащими повреждения и в ходе конформационного перехода обратимо превращается в активированную форму RecA*.



Активация белка RecA

  • Точно еще не выяснено как индукции SOS-сигнала, как и его природа, влияет на связывание белка recA с одноцепочечными участками ДНК содержащими повреждения.

  • Это обусловленно огромным разнообразием повреждений, которые индуцируют SOS-ответ. Возможны различные предположения:

  • RecA может активироваться некоторыми общими интермедиатами метаболизма ДНК.

  • Сигналом к активации может служить некоторая малая молекула, высвобождающаяся из ДНК при повреждении, или некоторая структура, которую формирует ДНК.



Индукция SOS-репарации

  • Молекулы белка LexA взаимодействуют с RecA* в результате чего активируется скрытая до этого аутопротеолитическая активностьбелка LexA.

  • Полипептидной цепь LexA расщепляется вблизи середины, что инактивирует его как репрессор.

  • В результате происходит индукция LexA-зависимых генов SOS-регулона.



Основные термины

  • SOS-репарация (мутагенез) – это согласованная индукция множества ферментов, включая ферменты репарации, в ответ на радиационные и другие повреждения ДНК.

  • SOS-бокс – это последовательность ДНК длиной приблизительно 20 п.н. узнаваемая белком-репрессором LexA.

  • Продукты экспрессии многих генов системы SOS-ответа участвуют в различных репарационных процессах.

  • SOS-ответ заключается в резком возрастании способности клетки репарировать свой геном, за счет усиления синтеза различных компонентов систем рекомбинацинной и эксцизионной репарации.



Индукция SOS-репарации

  • Ключевыми белками, задействоваными в процессе введения ошибок ДНК-полимеразой, являются продукты двух генов – umuD и umuC.

  • Они составляют единый umuCD-оперон, находящийся под контролем репрессора LexA, а следовательно входящий в состав SOS-регулона, активирующегося при наличии непреодолимых препятствии для репликации клеточной ДНК.

  • Во время индукции SOS-ответа белок UmuD, подобно белку LexA, расщепляется по аутокаталитическому механизму, запускаемому при взаимодействии с RecA*.

  • В результате образуется полипептид UmuD’ , включающий С-концевые остатки UmuD. В клетке UmuD’ существуют в виде гомодимеров, которые способны объединяться с белком UmuС, образуя комплекс (UmuD’)2–UmuC .



ДНК-полимераза 5

  • Настоящая роль белкового комплекса (UmuD’)2–UmuC в процессе SOS-репарации неизвестна. Существует две основных концепции:

  • Комплекс может изменять процессивность ДНК-полимеразы, подавлять ее корректирующую 3’→5’-экзонуклеазную активность или изменять конформацию фермента на такую, при которой она начинает неадекватно оценивать пространственную структуру комплекса, образующегося с участием Уотсон–Криковских водородных связей между нуклеотидом матрицы и очередным входящим нуклеотидом.

  • Установлено, что тример (UmuD’)2–UmuC сам по себе обладает слабой ДНК-полимеразной активностью и, возможно, именно этот комплекс осуществляет синтез ДНК непосредственно в поврежденном участке в присутствии всех вышеупомянутых компонентов. В этой связи тример получил название ДНК-полимеразы V Е. coli.



Индукция SOS-репарации

  • Когда репликаза (ДНК-полимераза 3) доходит до некоторого повреждения, например тиминового димера, она останавливается. Белок RecA участвует в формировании так называемых нуклеиново-белковых филаментов в местах одноцепочечных брешей на поврежденной ДНК.

  • С этими филаментами могут соединяться белки UmuD’ и UmuC в составе активного комплекса. Предполагают, что в результате такого взаимодействия комплекс (UmuD’)2–UmuC осуществляет переключение репаративного синтеза ДНК с нужд гомологичной рекомбинации на SOS-мутагенез.

  • После привлечения комплекса (UmuD’)2–UmuC к месту повреждения, он вытесняет кор-фермент ДНК-полимеразы 3 и занимает его место, начиная полимеризацию случайных нуклеотидов на поврежденной матрице.

  • Фактически такая ДНК-полимераза 5 использует большинство вспомогательных субъединиц ДНК-полимеразы 3.



Функции белка RecA

  • Таким образом белок RecA играет ключевую роль в индукции SOS-репарации, выполняя следующие важные функции:

  • Взаимодействует с белком LexA, в результате чего он расщепляется и теряет свои репрессорные своиства, тем самым запуская SOS-ответ

  • Взаимодействует с белком UmuD, в результате чего он расщепляется и приобретает способность взаимодействовать с белком UmuC с образованием активного комплекса (UmuD’)2–UmuC.

  • Участвует в формировании нуклеиново-белковых филаментов в местах одноцепочечных брешей на поврежденной ДНК, привлекая на них активный (UmuD’)2–UmuC, который осуществляет неточный синтез ДНК, в виде ДНК-полимеразы 5.



ДНК-полимераза 4

  • ДНК-полимераза IV E. coli, кодируемая геном dinB, также участвует в SOS-ответе бактерий:

  • Она не обладает 3'→5'-экзонуклеазной активностью и способна включать нуклеотиды в строящуюся цепь ДНК по высокодистрибутивному механизму. При каждом контакте фермента с субстратом и гибридом праймер–матрица к праймеру присоединяется единственный нуклеотид.

  • Если во время репликации участков ДНК с простыми повторяющимися последовательностями в результате их повреждения происходит включение неправильно спаренного нуклеотида с последующим проскальзыванием 3'-конца строящейся цепи ДНК и образованием мутации со сдвигом рамки считывания, то происходит задержка репликативного комплекса и его диссоциация. В этих условиях синтез ДНК может быть продолжен ДНК-полимеразой IV, которая путем внесения дополнительных мутаций может исправить первоначальный сдвиг рамки.

  • ДНК-полимеразы IV и V являются членами большого семейства, включающего в себя эукариотические ДНК-полимеразы, которые так или иначе причастны к репарации повреждений ДНК.



Окончание SOS-репарации

  • После того, как весь геном был успешно реплицирован, путем введения мутации в последовательности, которые блокировали продвижение репликативной вилки, клетка имеет возможность быстро вернуться из состояния SOS-ответа к нормальному функционированию.

  • При исчезновении индуцирующего SOS-ответ сигнала, белок RecA резко теряет способность дестабилизировать LexA.

  • В результате LexA будет экспрессироваться на высоком уровне, быстро накапливаться в нерасщепленной форме и связываться с SOS-боксом, ингибируя SOS-репарацию.



Вырезание профагов

  • Активация RecA так же может являться причиной расщепления и других репрессорных белков, например репрессоров лизогенных профагов (фаг λ):

  • Это объясняет почему вырезание фага λ из бактериального генома может быть индуцировано ультрафиолетовым светом.

  • Лизогенный репрессор расщепляется и тем самым позволяет фагу встать на литический путь.

  • Выживание вируса несомненно выше при литическом пути, когда происходит вырезание профага из бактериального генома и образование дочерних фагов, которые могут заражать не поврежденные клетки.

  • Профаги, не участвующие в реакциях SOS-ответа, тем не менее могут реагировать на повышение концентрации активного RecA в клетке, используя это как сигнал к вырезанию из бактериального генома.













Cowcatcher model



Эукариотические ДНК полимеразы







Рекомендуемая литература

  • Л.И. Патрушев Экспрессия генов, 2000.

  • М.Сингер, П.Берг Гены и геномы, 1998.

  • В. Н. Сойфер Репарация генетических повреждений, СОЖ №8, 1997.

  • Ф.Айала, Дж.Кайгер Современная генетика, в 3-х томах, 1987.

  • Watson et al. Molecular biology of the gen, 5th edition, 2004.

  • Alberts et al. Molecular biology of the cell, from http://www.dnathink.org

  • Lewin Genes 8th edition, update 2002.

  • Leninger Principles of Biochemistry, 4th edition, 2004.

  • Z. Livneh DNA Damage Control by Novel DNA Polymerases: Translesion Replication and Mutagenesis JBC Vol. 276, pp. 25639–25642, 2001.



Каталог: files -> sms -> sample
files -> Тема: Детский травматизм. Травма мягких тканей лица и органов рта у детей. Особенности первичной хирургической обработки ран лица. Показания к госпитализации ребенка
files -> Тематичний план практичних занять
sms -> Программа курса " Микробиология и молекулярная биология "
sms -> Правилах работы в лаборатории, особенностях работы со световым микроскопом; в результате изучения курса «Анатомия растений» учащиеся формируются умения: изготавливать временные препараты
sms -> Нуклеиновые кислоты: их структура и функции в живых организмах
sample -> Молекулярная биология Транскрипция Определение
sms -> Программа по курсу «Биохимия и цитология»


Достарыңызбен бөлісу:




©stom.tilimen.org 2022
әкімшілігінің қараңыз

    Басты бет