Работа выполнена по договору с Институтом цитологии ран



Дата25.04.2017
өлшемі33.26 Kb.
Характеристика моноклональных антител семейства XC к растворимым цитокератинам с помощью метода Western блоттинга

Работа выполнена по договору с Институтом цитологии РАН


Введение

При иммунизации препаратами цитокератинов (например, препаратами клеточных лизатов эпителиальных клеток) можно получить антитела разной специфичности – как к нерастворимому в водных растворах цитокератиновому скелету, так и к растворимым фракциям цитокератинов. Первая группа антител используется в основном в иммуногистохимии и иммуноцитохимии – для идентификации клеток эпителиальных опухолей (раковых клеток). Антитела второй группы, направленные в частности против растворимых фракций цитокератинов 8 и 19, используются для обнаружения этих антигенов в сыворотке крови больных злокачественными опухолями, т.е. как опухолевые маркеры, самым известным из которых является маркер CYFRA21-1.

Задачей нашего исследования является получение моноклональных антител обеих групп. Для этого мышей иммунизировали клеточными лизатами и проводили два целевых скрининга.

Приготовление тотальных клеточных лизатов.

Клетки всех используемых клеточных линий перед лизисом промывали несколько раз холодным буфером PBS, а затем лизировали в буфере RIPA. Лизаты осветляли центрифугированием. Для анализа методом Western блоттинга к супернатанту (собственно лизату) добавляли буфер для электрофореза с меркаптоэтанолом и прогревали 5 мин при 99ºС в твердотельном термостате. Концентрацию белка определяли по методу Брэдфорда, используя овальбумин для построения калибровочной кривой.


Электрофорез и иммуноблотинг


Электрофоретическое разделение белков проводили методом диск-электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии SDS (SDS-PAGE). Концентрирующий гель содержал 4% полиакриламида, разделяющий - 10%. Полимеризацию гелей вызывали последовательным добавлением TEMED и раствора персульфата аммония. Разделение белков проводили в блоках геля 90х60х1,5 мм при силе тока 30 мА на пластину в течение 2,5-3 ч.

Разделённые в полиакриламидном геле белки переносили на нитроцеллюлозную мембрану (BioRad) в камере для "мокрого" переноса (BioRad) в соответствии с инструкциями производителя. Для визуализации белковых полос использовали Ponceau S (Sigma)

Иммуноблотинг проводили в соответствии с методикой ECL (Western blotting protocols (Amersham). Все инкубации с антителами проводили при комнатной температуре. Сразу после переноса мембрану промывали несколько раз буфером. Затем мембрану блокировали в растворе сухого обезжиренного молока (Valio, Финляндия) в течение 1 ч. После этого мембрану отмывали от остатков молока (3 раза по 2-3 минуты) и добавляли раствор первичных антител (антитела разводили в 5% растворе BSA). После инкубации с первичными антителами мембрану промывали (3 раза по 5 мин) и помещали на 1 ч в раствор вторичных антител в 5% растворе молока. Затем мембрану промывали 3 раза по 5 мин и связавшиеся с антителами белки выявляли с помощью метода усиленной хемилюминесценции (ECL). Для этого нитроцеллюлозную мембрану промывали один раз водой (10-15 сек.) после чего инкубировали в растворе ECL в течение 1 мин и закладывали мембрану между двумя слоями прозрачной плетки. Хемилюминесцентное излучение регистрировали экспонированием на рентгеновскую плёнку CEA RP NEW.
РЕЗУЛЬТАТЫ WESTERN БЛОТТИНГА ЛИЗАТОВ 14 КЛЕТОЧНЫХ ЛИНИЙ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ РАЗЛИЧНЫХ АНТИТЕЛ К ЦИТОКЕРАТИНАМ приведены на иллюстрациях (см. ниже).
Антитела пан-цитокератиновой специфичности (Sigma) взаимодействуют с широким набором полос во всем исследуемом диапазоне молекулярного веса и достаточно однородно со всеми лизатами.
Антитела широкой специфичности для иммуногистохмии и иммуноцитохимии (cocktail, Scytek) также окрашивают довольно широкий спектр и по молекулярным весам и по представленности антигенов в различных линиях.
Референс-антитела фирмы Progen, которые и использует компания Roche в производстве набора на CYFRA21-1, демонстрируют более узкую специфичность. Аналогичную (или даже более узкую) картину Western-блоттинга дают и антитела, полученные фирмой Хема (клоны XC23, XC30, XC35, XC37, XC43). Это позволяет надеяться на получение более специфической для растворимых цитокератинов пары мкАТ и соответствующей тест-системы для мониторинга злокачественных новообразований легких.


Покраска антителами ХС23 (Хема)



Покраска коктейлем антител (cytokeratin Cocktail, Scytek)



Покраска антителами KS19.1 (Progen)



Покраска антителами KS19.2 (Progen)



Покраска антителами PAN CYTOKERATIN (SIGMA)



Каталог: html
html -> Вкладка лучше пломбы на 300%!
html -> Меридиан мочевого пузыря 7 (V) (меридиан мочевого пузыря «тай-ин» ноги)
html -> Вопрос 6: массовые инфекционные заболевания людей, С/х животных и растений. Основные пути передачи инфекции и их характеристика. Противоэпидемические и санитарно-гигиенические мероприятия в очаге бактериального заражения
html -> Центр инактивации х-хромосомы обыкновенных полевок: характеристика последовательностей ДНК и анализ экспрессии генов генетика 03. 02. 07
html -> Гены центра инактивации и модификации хроматина активной и неактивной х-хромосом у сумчатых генетика 03. 02. 07
html -> Изготвил: Н. Ангушева
html -> Химические методы остановки кровотечений
html -> Отчет о заседании, организованном комитетом по профилактике вирусных гепатитов
html -> Структурно-функциональная организация хромосом описторхид 03. 03. 04 Клеточная биология, цитология, гистология


Достарыңызбен бөлісу:


©stom.tilimen.org 2019
әкімшілігінің қараңыз

    Басты бет