Показано, что образующиеся в растворе комплексы дмсо-моче- вина индуцируют денатурацию сач



Pdf көрінісі
Дата24.07.2018
өлшемі62.12 Kb.

 

ºðºì²ÜÆ  äºî²Î²Ü  Ð²Ø²Èê²ð²ÜÆ  ¶Æî²Î²Ü  îºÔºÎ²¶Æð 



Ó×ÅÍÛÅ  ÇÀÏÈÑÊÈ  ÅÐÅÂÀÍÑÊÎÃÎ  ÃÎÑÓÄÀÐÑÒÂÅÍÍÎÃÎ  ÓÍÈÂÅÐÑÈÒÅÒÀ 

  

øÇÙdz ¨ Ï»Ýë³μ³ÝáõÃÛáõÝ                                     2, 2010 

      

      Õèìèÿ è áèîëîãèÿ 



 

 

 



 

  Х и м и я  

 

 



 

УДК 577.322.72 

 

 

К. Р. ГРИГОРЯН 



 

ДЕНАТУРАЦИЯ  СЫВОРОТОЧНОГО  АЛЬБУМИНА ЧЕЛОВЕКА  В  ПРИ-

СУТСТВИИ КОМПЛЕКСОВ МОЧЕВИНЫ С ДИМЕТИЛСУЛЬФОКСИДОМ 

 

Методами  УФ-  и  флуоресцентной  спектроскопии  изучена  химическая 



денатурация  сывороточного  альбумина  человека  (САЧ)  в  водно-диметил-

сульфоксидных (ДМСО) растворах в присутствии мочевины при температу-

ре 60

0

С.  Показано,  что  образующиеся  в  растворе  комплексы  ДМСО–моче-



вина  индуцируют  денатурацию  САЧ.  Выдвинуто  предположение  о  двуста-

дийном характере денатурации САЧ в присутствии этих комплексов: первая 

стадия – разрыхление  белковых  глобул,  вторая – полное  разворачивание 

молекул  белка.  В  системе  САЧ–мочевина–ДМСО  превалируют    гидрофоб-

ные  взаимодействия.  

          



Введение. Химическая денатурация белков достигается, прежде всего, 

с  помощью  соединений,  разрывающих  водородные  связи (6–8 М  раствор 

мочевины, 4–6 М раствор гидрохлорида гуанидина), обработкой кислотами и 

щелочами, а также воздействием поверхностно активных веществ. Денатура-

ция белка в их присутствии происходит по механизму «все или ничего» [1–3]. 

Мочевина,  независимо  от  концентрации,  обратимо  связывается  с  белками, 

тем самым делает возможным изучение процесса свертывания белков. Авто-

ры [4] показали, что при низких концентрациях мочевины (

>2 М), образуется 

расплавленная глобула с необычной гидратированной структурой и увеличи-

вающимся радиусом Стокса. 

Низкомолекулярные  органические вещества, такие  как спирты  и  кето-

ны, в зависимости от концентрации проявляют стабилизирующее/дестабили-

зирующее действие [5, 6] при денатурации сывороточных белков, в частности 

сывороточного альбумина человека (САЧ). Такими же свойствами обладают 

диалкилсульфоксиды [7, 8].  

В  настоящей  работе  изучена  денатурация  САЧ  в  водных  растворах 

диметилсульфоксида (ДМСО) в присутствии мочевины. 



Материалы  и  методы.  В  работе  использовали  САЧ    (содержание  

жирных  кислот  менее 0,005%) и  ДМСО  фирмы “Sigma” (США),  раствор 

хлорида  натрия (“Ликвор”,  Армения),  мочевину  марки  ч.д.а.  Концентрация 

САЧ составляла 0,4 мг/мл, которую определяли с помощью УФ-спектроско-

пии  при 

λ

=280  нм.  Значение  молярного  коэффициента  поглощения  (



max

ε



принимали  равным 36500 M

–1

·см



–1

 [9]. Концентрация  ДМСО  варьировалась 

от 10 до 30%. 


 

УФ-спектрометрические измерения проводили с помощью спектромет-



ра Specord 50PC (Германия).  Для  поддержания  постоянной  температуры 

использовали  циркулирующий  термостат Lauda A100, входящий  в  комплек-

тацию спектрометра. Использовали кюветы толщиной 1 см

Флуоресцентные  измерения  проводили  с  помощью  спектрофотометра 

Varian Cary Eclipse (Австралия)

.

  Спектры  были  зарегистрированы  в  интер-



вале 

λ

=300–450 нм при длине волны возбуждения 



λ

=295 нм.  

Графические  зависимости  анализировали  с  помощью  компьютерной 

программы ORIGIN 8.0. 



Результаты  и  обсуждение.  Структура  САЧ  представляет  собой  одну 

длинную полипептидную цепь, состоящую из 586 аминокислотных остатков, 

уложенную  в 3 связанных  глобулярных  сегмента,  конформация  которых 

фиксируется 17 дисульфидными  связями.  САЧ  имеет  максимальное  погло-

щение в УФ-области при λ=280 нм, что обусловлено наличием ароматических 

аминокислот триптофана (Trp), тирозина (Tyr) и фенилаланина (Phe). Погло-

щение Phe при 250 нм обусловлено π→π*-переходом. Для Tyr  наблюдаемое 

поглощение  интенсивнее 

1

1

max



(274

,

1400



)

нм

M

см

ε



=



.  Спектр  индольной 

боковой группы Trp имеет сложную природу. В достаточно узком интервале 

длин  волн  (от 240 до 290 нм)  располагаются  три  или  более  электронных 

перехода, 

1

1

max



~ 5700 M

см

ε



, так что поглощение САЧ при 280 нм можно 



отнести к Trp-остаткам. Этими же аминокислотными остатками обусловлена 

флуоресценция белков. 

 

0

100



200

300


400

0,34


0,35

0,36


0,37

0,38


0,39

0,40


0,41

0,42


t, 

ìèí

a

á

      

300


350

400


450

500


0

10

20



30

40

50



60

70

80



90

100


110

120


130

140


4

3

2



1

 

 



 

 

 



На рис. 1 представлено изменение оптической плотности раствора САЧ  

в  присутствии  мочевины (6 М)  при 60

0

С.  Температурно-контролируемые 

преобразования  конформации  белков  имеют  важное  регуляторное  значение. 

При  повышении  температуры  выше  физиологически  умеренного  уровня 

(более 37

0

С)  начинает  проявляться  хаотропное  действие  температуры  на 

конформацию  белка.  Оно  дестабилизирует  структуру  белковой  глобулы  и 

при  достижении  критической  температуры  в  интервале 60–100

0

С  денатури-

рует ее. Как видно из рис. 1, оптическая плотность раствора остается практи-

Рис. 1. УФ-профили химической денатурации     Рис. 2. Спектры флуоресценции САЧ (0,4 мг/мл

САЧ  (0,4 мг/мл)  в  присутствии  мочевины         в   присутствии   мочевины   (6 М):   1 – 0 мин

                     (6 М)  при 60

0

С.                                           2 – 60 мин, 3 – 180 мин, 4 – 270 мин

А 

tмин

б

а 



λнм

 

 

3



4

2

1



 

 

Интен



сивно

сть


 (

у.

е.) 



 

чески  неизменной  почти 200 мин,  что  говорит  о  стабильности  структуры 



белка. После чего на кривой денатурации замечаются два перехода: а – сла-

бый (240 мин) и б – резкий (360 мин), что указывает на то, что процесс дена-

турации нельзя описать механизмом «все или ничего». Во время денатурации 

вследствие разрыхления белковой глобулы образуются интермедиаты различ-

ной прочности, которые со временем подвергаются  полной денатурации. 

На  рис. 2 приведены  флуоресцентные  спектры  САЧ  в  присутствии 

мочевины.  С  увеличением  времени  наблюдается  снижение  интенсивности 

эмиссии Trp и  смещение  сигнала  в  сторону  высоких  длин  волн.  Это  свиде-

тельствует о том, что в системе превалируют взаимодействия, обусловленные 

образованием водородных связей. 

 

0

100



200

300


400

500


0,38

0,40


0,42

0,44


0,46

0,48


0,50

0,52


0,54

0,56


0,58

0,60


1

2

   



300

350


400

450


500

0

10



20

30

40



50

60

70



80

90

100



110

120


130

140


150

160


170

180


1

2

3



 

 

 



 

 

На  рис. 3 представлены  УФ-профили  химической  денатурации  САЧ  в 



присутствии мочевины (6 М) и ДМСО (10% и 30%) при 60

0

С. Сравнительный 

анализ показывает, что добавление ДМСО практически не меняет ход зависи-

мостей (см. рис. 1). Экстремум на кривой при 100 мин остается, а части (а) и (б) 

с повышением концентрации ДМСО (30%) сливаются. На основе ИК-спектро-

скопических исследований и Ab-initio теоретических расчетов выявлено обра-

зование различных молекулярных комплексов мочевины с ДМСО [10]. Так как 

ДМСО  (до 30%) при 60

0

С  в  отсутствие  мочевины  не  денатурирует  САЧ,  то 

причиной интенсивной денатурации САЧ в присутствии ДМСО можно считать 

наличие  комплексов  мочевина–ДМСО.  В  присутствии  этих  комплексов  в 

спектрах  флуоресценции  наблюдается  смещение  сигнала  в  сторону  коротких 

волн (рис. 4). Причем с увеличением концентрации ДМСО до 30% смещение 

становится более ощутимым: при 10% 

λ

Δ ≈ 8 нм, а при 30% 



λ

Δ ≈ 12 нм.  

Таким  образом,  можно  сказать,  что  денатурация  САЧ  в  присутствии 

комплексов мочевины с ДМСО происходит по двустадийной модели: первая 

стадия – разрыхление белковой глобулы, вторая стадия – полное разворачи-

вание  молекул  белка.  При  денатурации  в  системе  САЧ–мочевина–ДМСО 

превалируют  гидрофобные  взаимодействия.  

 

Кафедра физической и коллоидной химии                                                      Поступила 01.02.2010 

Рис. 3. УФ-профили химической денатурации     Рис. 4. Спектры флуоресценции САЧ (0,4 мг/мл

САЧ (0,4 мг/мл) в присутствии мочевины (6 М)    в   присутствии   мочевины  (6 М)   и   ДМСО:  

и  ДМСО  при  60

0

С:  1.  ДМСО 10%;  2.  30%.                 1. ДМСО – 0;  2.  10%;  3.  30%. 



А 

tмин

Интен


сивно

сть


 (

у.

е.) 



λнм

 

 

Л И Т Е Р А Т У Р А  



 

1.

 



Sutkowska A., Bojko B., Rownicka J., Pentak D. and Sutkowski W. J. Molec. Struct., 2003, 

v. 651, p. 237–243. 

2.

 

Ahmad B., Khursheed K., Hag S. and Khan R. Biochem. and Biophys. Res. Commun., 2004, 



v. 314,  p. 166–173. 

3.

 



Tjernberg A., Markova N., Griffiths W., Hallén D.  J. Biomolec. Screen.,  2006,  v. 11,  № 2, 

p. 131–137. 

4.

 

Muraldihara B. and Prakash V.  Current Science,  1997,  v. 72,  № 11,  p. 831–834. 



5.

 

Michnik A., Drzazga S.  J. Therm. Anal. and Calorim.,  2007,  v. 88,  p. 449–454. 

6.

 

Shan-Yang L., Yen-Shan W., Mei-Jane L., Shung –Li W. Europ. J. Pharm. Biopharm., 2004, 



v. 57,  p. 457–464. 

7.

 



Григорян К.Р.  Ученые записки ЕГУ. Химия и биология,  2009,  №3,  с. 3–5. 

8.

 



Григорян К., Маркарян Ш., Азнаурян М.  Проблемы криобиол., 2009,  т. 19, № 1, c. 3–9. 

9.

 



Singh A. and Darshi M.  New J. Chem.,  2004,  v. 28,  p. 120–126. 

10.


 

Markaryan S., Gabrielyan L., Grigoryan K.  J. Solut. Chem.,  2004,  v. 33,  № 8,  p. 1005.

 

 



 

Î. è. ¶ðƶàðڲܠ

 

زð¸àô  ÞÆÖàôβÚÆÜ  ²È´àôØÆÜÆ   ´Ü²öàÊàôØÀ  



ØƼ²ÜÚàô–¸ÆغÂÆÈêàôÈüúøêƸ  ÎàØäȺøêܺðÆ 

ܺðβÚàôÂڲش 

                              

² Ù ÷ á ÷ á õ Ù  

 

¾É»ÏïñáݳÛÇÝ ÏɳÝÙ³Ý ¨ ýÉáõáñ»ëó»Ýï³ÛÇÝ Ù»Ãá¹Ý»ñáí áõëáõÙݳ-



ëÇñí»É ¿ Ù³ñ¹áõ ßÇ×áõϳÛÇÝ ³ÉμáõÙÇÝÇ (ØÞ²) ùÇÙdzϳݠμݳ÷áËáõÙÁ çáõñ–

¹ÇÙ»ÃÇÉëáõÉýûùëǹ³ÛÇÝ (¸Øêú) ÉáõÍáõÛÃÝ»ñáõÙ Ùǽ³ÝÛáõÃÇ Ý»ñϳÛáõÃÛ³Ùμ 

60

0

C



 ç»ñÙ³ëïÇ׳ÝáõÙ£ òáõÛó ¿ ïñí»É, áñ  ÉáõÍáõÛÃáõÙ ³é³ç³óáÕ ¸Øêú–

Ùǽ³ÝÛáõà ÏáÙåÉ»ùëÝ»ñÁ ѳñáõóáõÙ »Ý ØÞ²-Ç μݳ÷áËáõÙ£ ²é³ç ¿ ù³ßí»É  

»Ýó¹ñáõÃÛáõÝ, áñ ØÞ²-Ç μݳ÷áËáõÙÁ Çñ³Ï³Ý³ÝáõÙ ¿ »ñÏáõ ÷áõÉáí. 

³é³çÇÝÁ` ëåÇï³Ïáõó³ÛÇÝ ·ÉáμáõÉÝ»ñÇ Ë³ñËÉáõÙ, »ñÏñáñ¹Áª ëåÇï³ÏáõóÇ 

ÙáÉ»ÏáõÉÇ ³ÙμáÕç³Ï³Ý ù³Ý¹áõÙ£ ØÞ²–Ùǽ³ÝÛáõÖ¸Øêú ѳٳϳñ·áõÙ 

·»ñÇßËáõÙ »Ý Ñǹñáýáμ ÷á˳½¹»óáõÃÛáõÝÝ»ñÁ£   

 

 

K. R. GRIGORYAN 



 

DENATURATION OF HUMAN SERUM ALBUMIN AT THE PRESENCE 

OF UREA–DIMETHYLSULFOXID COMPLEXES 

 

S u m m a r y  



 

Human serum albumin (HSA) chemical denaturation at 60

0

C in aqueous-

dimethylsulfoxide (DMSO) solutions at the presence of urea  has been investigated 

by the Uv/vis spectroscopy method. It has been shown that DMSO–urea 

complexes, which have been formed in the solution, induce the HSA denaturation.  

A suggestion  has been made that the HSA denaturation has two stages at the 

presence of these complexes: the first stage – protein globule loosening and the 

second – full unfolding of protein molecule. In the HSA–urea–DMSO system  

predominate  hydrophobic interactions.   



Каталог: files
files -> 1 дәріс : Кіріспе. Негізгі түсініктер мен анықтамалар. Тиеу-түсіру жұмыстары жөніндегі жалпы түсініктер
files -> Қыс ең зақымданатын жыл мезгілі. Бірақ жаралану, сынық, тоңазу, үсіп қалу біздің қысқы тұрмыстың міндетті салдары емес
files -> Қазақ халқының ұлттық ойындары
files -> Тема: Детский травматизм. Травма мягких тканей лица и органов рта у детей. Особенности первичной хирургической обработки ран лица. Показания к госпитализации ребенка
files -> Тематичний план практичних занять


Достарыңызбен бөлісу:


©stom.tilimen.org 2019
әкімшілігінің қараңыз

    Басты бет