Определения гемоглобина

Министерство здравоохранения Российской Федерации

Государственное образовательное учреждение высшего 

профессионального образования ММА им. И.М. Сеченова

ГЕМИХРОМНЫЙ МЕТОД 

ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГЕМОГЛОБИНА  

В КРОВИ

Информационно-методическое пособие 

Москва

2002

Пособие для врачей клинической лабораторной диагностики «Гемих-

ромный метод определения гемоглобина в крови» содержит: основные све-

дения по строению и свойствам гемоглобина, характеристику гемихромно-

го  метода,  подробную  методику  и  способ  проведения  анализа,  сравнение 

гемихромного  метода  с  гемиглобинцианидным,  сведения  об  источниках 

возможных погрешностей. Объективной основой для внедрения в практи-

ку  гемихромного  метода  определения  гемоглобина  является  создание  на-

бора реагентов, не содержащего токсичных веществ. Разработанный набор 

реагентов  для  определения  гемоглобина  в  крови  гемихромным  методом 

«Гемоглобин-Ново»  рекомендован  комиссией  по  лабораторным  реагентам 

Комитета  по  новой  медицинской  технике  Министерства  здравоохранения 

Российской Федерации (протокол № 8 от 24 ноября 1997 г.) к серийному вы-

пуску и применению в медицинской практике. 

Показано, что гемихромный метод анализа по правильности, воспро-

изводимости  и  чувствительности  сравним  с  гемиглобинцианидным  мето-

дом, а по скорости проведения анализа (5 минут против 20 минут) и срокам 

годности трансформирующего раствора (6 месяцев против 3 месяцев) пре-

восходит его.

Пособие  предназначено  для  врачей  клинической  лабораторной  диа-

гностики, медицинских технологов, медицинских техников, биологов.

Организации-разработчики:

Государственное образовательное учреждение высшего профессионально-

го образования ММА им. И.М. Сеченова; ЗАО «Вектор-Бест».

Авторы: 

Т.И.  Лукичева  –  к.м.н.,  ведущий  научный  сотрудник  лаборатории  проблем 

клинико-лабораторной диагностики Государственного образовательного учреж-

дения высшего профессионального образования ММА им. И.М. Сеченова;

В.И.  Пупкова  –  к.х.н.,  заведующая  лабораторией  аналитической  биохимии 

ЗАО «Вектор-Бест».

Рецензенты:

В.Н. Титов – д.м.н., профессор, руководитель лаборатории клинической биохимии 

Российского кардиологического научно-производственного комплекса МЗ РФ;

Ю.Е. Михайлов – к.м.н., заведующий лабораторией Научного центра хирур-

гии РАМН.

3

ВВЕДЕНИЕ

Определение концентрации гемоглобина в крови является наи-

более распространенным исследованием в КДЛ. Это важнейший по-

казатель (наряду с подсчетом эритроцитов) для оценки анемических 

состояний в клинической практике. 

Предложено  много  методов  определения  гемоглобина,  и  сте-

пень надежности получаемых результатов варьирует в зависимости 

от применяемого метода. Международным комитетом по стандарти-

зации в гематологии (JCSH) в 1963 г рекомендовано использовать в 

качестве  стандартного  метода  гемиглобинцианидный,  разработан-

ный Драбкиным в 1932 г. 

С  развитием  аналитических  методов  исследования  появилась 

возможность заменить цианистые соединения более безопасными. В 

настоящем пособии изложен гемихромный метод определения гемо-

глобина, в котором превращение гемоглобина в окисленную форму 

осуществляется  раствором,  содержащим  в  качестве  лизирующего 

агента  додецилсульфат  натрия.  Данный  метод,  реализованный  в 

коммерческих  наборах  реагентов,  рекомендованных  Минздравом 

России к применению в КДЛ, безопасен для сотрудников, проводя-

щих  анализ,  и  позволяет  получать  результаты  определения  гемо-

глобина с такой же степенью надежности, как и при использовании 

гемиглобинцианидного метода.

4

ПОКАЗАНИЯ И ПРОТИВОПОКАЗАНИЯ 

К ПРИМЕНЕНИЮ МЕТОДА

Показания к применению метода

Определение гемоглобина является одним из наиболее важных 

и распространенных исследований в клинической лабораторной ди-

агностике.  Оно  проводится  при  различных  заболеваниях,  а  также 

при контроле за лечением: всех видов анемий, связанных с крово-

потерей, с нарушением кровообращения, с повышенным кровераз-

рушением; при первичных и вторичных эритроцитозах, эритремии, 

полицитемии и других заболеваниях человека.

Противопоказания к применению метода

Противопоказаний нет.

5

МАТЕРИАЛЬНО-ТЕХНИЧЕСКОЕ ОБЕСПЕЧЕНИЕ МЕТОДА

Для  определения  гемоглобина  в  крови  гемихромным  мето-

дом  необходимо  оборудование,  имеющееся  практически  в  каждой 

клинико-диагностической  лаборатории.  Внедрение  гемихромного 

метода определения гемоглобина не требует технического переосна-

щения  лабораторий  приборами  и  оборудованием.  Используемые 

приборы и оборудование серийно выпускаются отечественной и за-

рубежной  промышленностью  и  разрешены  к  применению  в  широ-

кой медицинской практике Минздравом РФ:

1.  Гемоглобинометр  фотоэлектрический  типа  «Гемолан-500», 

АО  НИКИ  МЛТ,  рег.  №  90/345-56;  колориметр  автомати-

ческий  медицинский  цифровой  КАМЦ-1,  АО  НИКИ  МЛТ,  

рег. № 81/823-65; фотометры: «Минилаб 501», рег. № 29-7-1838-2001; 

«Stat-Fax 1904», Awareness Technology Inc., США, рег. № 95/244; 

фотометр 5010, Boehringer Mannheim, Германия, рег. № 96/450; 

«Спекол 11», Карл Цейс, Германия, рег. № 21/7-38-86 и др.

2.  Дозаторы жидкостей одноканальные объемом от 20 до 5000 мкл ти - 

па «ДПВ-1, ДПФ-1», ЗАО «СПб-Лабсистемс», рег. № 29/070506921613-01.

3.  Встряхиватель медицинский типа «Вортекс», модель V 3, Elmi Ltd., 

Швеция-Латвия, рег. № 96/638.

4.  Калькулятор.

5.  Наборы реагентов для определения гемоглобина в крови гемихром-

ным методом: набор реагентов для определения гемоглобина в кро-

ви  гемихромным  методом  «Гемоглобин-Ново»,  ЗАО  «Вектор-Бест»,  

рег. № 29/25081197/0404-00; набор калибровочных растворов гемих-

рома «Гемосо-Ново», ЗАО «Вектор-Бест», рег. № 29/25081197/0403-00;  

набор  контрольных  растворов  гемоглобина  «Гемоконт-Ново»,  ЗАО 

«Вектор-Бест», рег. № 29/25050501/3535-02.

6

ОПИСАНИЕ МЕТОДА

Предлагаемый  гемихромный  метод  определения  гемоглобина 

в  крови  отличается  от  гемиглобинцианидного  метода  отсутствием 

цианистых  соединений  в  составе  рабочего  реагента  и  заменой  их 

на более безопасные соединения; быстротой проведения реакции и 

большей производительностью.

В этом разделе кратко изложены основные функции, строение и 

свойства гемоглобина и методы его определения.

Гемоглобин. Основные функции. Строение. Свойства

Принятые обозначения:

Hb – гемоглобин;

HbS – сульфогемоглобин;

HbF – фетальный гемоглобин;

HbChr – гемихром;

HbCN – гемиглобинцианид;

SDS – натрия додецилсульфат;

ПАВ – поверхностно-активные вещества.

Гемоглобин – основной дыхательный пигмент и главный ком-

понент  эритроцитов,  выполняющий  важные  функции  в  организме 

человека: перенос кислорода от легких в ткани, выведение углекис-

лого газа из организма и регуляция кислотно-основного состояния 

крови. Буферная система, создаваемая Hb, способствует сохранению 

рН крови в определенных пределах.

Гемоглобин – красный пигмент крови человека и животных, от-

носящийся к хромопротеидам. Молярная масса гемоглобина состав-

ляет ~68 000. В крови человека в среднем содержится ~14,5% Hb,  

его общее количество ~750 г. Hb представляет собой сложный бе-

лок,  белковый  компонент  в  котором  представлен  глобином,  не-

белковый  –  простетической  группой.  Простетическая  группа  в 

молекуле Hb представлена 4 одинаковыми железопорфириновы-

ми соединениями, которые образуют гем. Молекула гема состоит 

из протопорфирина IХ, связанного через 4 атома азота с железом 

двумя ковалентными и двумя координационными связями. Атом 

железа (II) расположен в центре гема и придает крови характер-

ный красный цвет [1] (рис. 1).

Видовые  различия  Hb  обусловлены  химическим  составом  и 

строением  белкового  компонента  –  глобина.  Молекулы  Hb  пред-

7

ставляют собой тетрамерные белки, отличающиеся строением поли-

пептидных цепей, обозначаемых как a, b, g, d. В состав Hb входят 

две пары полипептидных цепей двух типов. Гемоглобины различ-

ных видов имеют различия во вторичной, третичной и четвертичной 

структуре, поэтому свойства их индивидуальны. Известно, что гемо-

глобин человека состоит из двух равных половин, каждая из которых 

образована двумя одинаковыми полипептидными цепями. В крови 

человека имеются Hb различных типов, отличающиеся по строению. 

Основным  Hb  крови  взрослого  человека  является  HbA  (~97%),  со-

стоящий из a

2

b

2

 цепей, а также HbA2 (~2,5%). Кроме того, в крови 

взрослого человека со-держится до ~1,5% HbF. Кровь новорожден-

ного ребенка состоит на ~80% из HbF, который к концу первого года 

жизни почти целиком заменяется на HbA. 

Гемоглобин  у  новорожденных  (фетальный)  имеет  структуру 

a

2

g

2

, что значительно обусловливает и различия Hb взрослых и де-

тей: по спектральным характеристикам, электрофоретической под-

вижности, устойчивости к тепловой денатурации и др. [2, 3].

Незначительное изменение аминокислотного состава глобина, 

иногда замена лишь одной аминокислоты в полипептидной цепи Hb,  

полностью  изменяет  его  свойства.  Так,  замена  в  HbA  глутамино-

вой кислоты на валин приводит к превращению его в сульфогемо-

глобин – HbS, имеющий структуру a

2

s

2

. Этот Hb, обнаруженный у 

больных серповидно-клеточной анемией, по своим свойствам отли-

чается от нормального. После отдачи кислорода в тканях HbS пре-

вращается в плохо растворимую форму и выкристаллизовывается в 

Рис.1. Строение гема.

8

эритроцитах,  вызывая  их  деформацию  (образование  серповидных 

форм), это приводит к нарушению функций эритроцитов [4]. 

Гемоглобин – кристаллическое вещество, хорошо растворимое в 

воде и нерастворимое в спирте, эфире и хлороформе. В эритроцитах 

Hb находится в растворенном состоянии, несмотря на то, что его со-

держание более 30%. При изменении аминокислотного состава гло-

бина может произойти и изменение его растворимости, как у HbS. 

Растворы Hb окрашены в темно-красный цвет и имеют харак-

терные спектры поглощения в ультрафиолетовой и видимой области 

спектра; изоэлектрическая точка Hb ~7. В кислой и щелочной среде 

Hb легко денатурируется, скорость денатурации различна у разных 

видов Hb. В кислой среде связь между гемом и глобином легко раз-

рывается. Свободный гем легко окисляется кислородом воздуха до 

гематина, в котором атом железа трехвалентен [1].

Наиболее характерным свойством Hb является обратимое при-

соединение газов О

2

, СО. Образовавшиеся при этом соединения на-

зываются оксигемоглобином и карбоксигемоглобином, соответствен-

но. Реакция присоединения молекулярного кислорода не является 

истинным окислением Hb, так как валентность железа в геме при 

этом не изменяется, и эту реакцию правильнее называть оксигена-

цией. Истинное окисление Hb происходит только тогда, когда желе-

зо переходит в трехвалентное состояние. 

В  крови  Hb  находится,  по  крайней  мере,  в  четырех  формах: 

оксигемоглобин, дезоксигемоглобин, карбоксигемоглобин, метгемо-

глобин. В эритроцитах молекулярные формы Hb способны к взаимо-

превращению,  их  соотношение  определено  индивидуальными  осо-

бенностями организма [1–4].

Методы анализа. Общая характеристика методов

Определение содержания Hb в крови человека является одним 

из самых важных и массовых показателей. Для его определения чаще 

всего анализируют производные Hb, образовавшиеся в процессе его 

окисления  и  присоединения  к  гему  различных  химических  групп, 

приводящих к изменению валентности железа и окраски раствора. 

Из «старых» методов, все еще применяемых в ряде лабораторий, 

остановимся на следующих: сапониновом и методе Сали [5, 6]. 

При использовании сапонинового метода тельца Гейнца не рас-

творяются, раствор остается мутноватым, за счет чего может меняться 

спектр поглощения раствора, и ошибка при этом достигает 20–30%. 

9

В методе Сали измеряется гематин, образовавшийся при вза-

имодействии Hb с соляной кислотой. Метод основан на визуаль-

ной  оценке  содержания  Hb  путем  сравнения  окраски  исследуе-

мой пробы со стандартными растворами солянокислого гематина. 

Ошибка метода достигает ~30%, на результаты определения вли-

яют многие факторы: время реакции между Hb и соляной кисло-

той, которое может колебаться от 2 до 40 мин в зависимости от со-

держания белков крови; оттенок цвета геминхлорида, зависящий 

от  содержания  билирубина  в  крови;  характер  освещения  и  пр.  

Химические  и  спектрофотометрические  методы  имеют  высокую 

точность и рекомендуются в качестве референсных, но из-за тру-

доемкости и значительной стоимости анализа для рутинных опре-

делений Hb не применяются. Для рутинных лабораторных иссле-

дований наиболее предпочтительны колориметрические методы, 

как наиболее дешевые, простые и быстрые в исполнении. Кровь 

человека – это нормальная смесь производных Hb с различными 

спектрами поглощения. При количественном определении Hb ко-

лориметрическими  методами  возникает  проблема  в  выборе  реа-

гента, который превращал бы все производные Hb только в одну 

форму перед фотометрическим анализом. Лучшими методами, ко-

личественно превращающими Hb в его производные, оказались: 

гемиглобинцианидный (HbCN), гемихромный (HbChr) и гемигло-

биназидный  (HbN

3

),  дающие  наименьшую  ошибку  определения 

при фотометрировании [7, 8]. Однако, гемиглобиназидный метод 

имеет ряд недостатков: конечный продукт превращения Hb – HbN

3

 

имеет слабый пик поглощения при l = 540 нм, что не дает возмож-

ности  использовать  фотометры  с  широкополосными  фильтрами; 

иногда возникают проблемы, связанные с мутностью растворов ге-

миглобиназида; раствор HbN

3

 не хранится при комнатной темпе-

ратуре. Напротив, гемиглобинцианидный и гемихромный методы 

лишены  этих  недостатков  и  при  дальнейших  исследованиях  им 

было отдано предпочтение. 

Гемиглобинцианидный метод 

Принцип  гемиглобинцианидного  метода  основан  на  перево-

де всех форм Hb в одну – HbCN. Перевод Hb в HbCN осуществляет-

ся  при  его  взаимодействии  с  трансформирующим  раствором,  содер-

жащим феррицианид калия, цианид калия, дигидрофосфат калия и 

неионный детергент. Дигидрофосфат калия поддерживает уровень рН,  

при котором реакция проходит за 3–5 минут. Детергент усиливает 

10

гемолиз  эритроцитов  и  предотвращает  мутность,  связанную  с  бел-

ками плазмы. Феррицианид калия окисляет все формы Hb в метге-

моглобин, который образует с цианистым калием HbCN, имеющий 

красноватый цвет, интенсивность которого прямо пропорциональна 

концентрации Hb в пробе [9].

Гемиглобинцианидный метод был одобрен Международным Ко-

митетом по стандартизации в гематологии (ICSH) в 1963 г. [10, 11]. 

В  нашей  стране  гемиглобинцианидный  метод  был  рекомен-дован 

к  применению  Министерством  здравоохранения  в  1974  г.:  Приказ 

Минздрава РФ № 960 от 5 октября 1974 г. «Об унификации клини-

ческих лабораторных методов исследований» п. 2.1.1. [Определение 

гемоглобина крови гемиглобинцианидным методом с применением 

ацетонциангидрина, М., 1974, 29–34].

Основные достоинства гемиглобинцианидного метода: 

– 

HbCN является стабильным производным Hb, и все имеющиеся 

в крови формы Hb, кроме сульфогемоглобина, могут быть бы-

стро и количественно превращены в HbCN;

– 

спектр поглощения HbCN имеет максимум при l = 540 нм, по-

этому достаточная точность анализа возможна при измерении 

оптической плотности на фотометрах даже с неинтерференци-

онными светофильтрами;

– 

растворы HbCN строго подчинены закону Ламберта-Бера при  

l

 = 540 нм в широком диапазоне концентраций;

– 

калибровочный раствор HbCN устойчив в течение нескольких лет.

Калибровочный раствор гемиглобинцианида

Международный  калибровочный  раствор  HbCN  готовится  от 

имени ICSH с относительной погрешностью, не превышающей 0,2%, 

и  используется  для  аттестации  коммерческих  калибровочных  рас-

творов  [12].  Требование  к  пределу  допустимого  значения  система-

тической  погрешности  при  определении  концентрации  гемоглоби-

на в коммерческих калибровочных растворах ≤ ±2% по сравнению с 

Международным калибровочным раствором.

Гемихромный метод

В  настоящее  время  для  определения  Hb  в  крови  разрабо-

тан новый колориметрический метод, не содержащий в составе 

реагентов  цианистых  соединений,  получивший  название  ге-

михромного. 

11

Принцип гемихромного метода

Принцип гемихромного метода основан на переводе всех форм 

Hb в одну – гемихром (HbChr). При взаимодействии Hb с трансфор-

мирующим  раствором  происходит  его  превращение  в  окисленную 

низкоспиновую форму – гемихром, имеющую красноватый цвет, ин-

тенсивность  которого  прямо  пропорциональна  концентрации  Hb  в 

пробе [13, 14]. 

Трансформирующие реагенты

Для перевода Hb в HbChr имеется несколько трансформирую-

щих реагентов, отличающихся по составу:

– 

четвертичные аммониевые основания с ПАВ: т-ок тил фе но кси-

полиэтокси-этанол, полигидроксилаурилэтиловый эфир, с тор-

говым названием Triton X-100 и Brij-35, соответственно, и дру-

гие, имеющие общую формулу [15, 16]:

R

1

+

Ι

R

2

 ─ N ─ R

3

X–

Ι

R

4

где:  R

1

–R

3

 – короткие алкильные группы, содержащие от 1 до 4 атомов углерода;

 

R

4

 – алкильная группа, содержащая от 12 до 16 атомов углерода;

 

Х – галоген.

– 

соли жирных кислот (С14–С20) с феррицианидом калия и ЭДТА 

в трис-буфере [17, 18];

– 

SDS [19, 20];

– 

другие агенты, не содержащие цианидов [21–28].

Из перечисленных трансформирующих реагентов лучшим яв-

ляется SDS. Максимальная скорость превращения Hb в HbChr от-

мечена именно при его взаимодействии с SDS. Полное превращение 

Hb происходит в пределах 5 мин. Высокая скорость реакции позво-

ляет использовать данный метод в качестве экспресс-метода и при-

менять для определения Hb при неотложных состояниях. 

Калибровочный раствор гемихрома

До последнего времени в практике гемихромного метода от-

сутствовали калибровочные растворы гемихрома. Концентрацию 

Hb в крови определяли по-разному: по коэффициенту молярной 

экстинкции,  который  по  данным  различных  авторов,  находится 

12

в пределах 9,86–10,45 [14, 16]; по калибровочным растворам раз-

личного состава [19, 20], но не гемихрома; по контрольному рас-

твору  гемоглобина  [29,  30],  аттестованному  с  высокой  степенью 

точности. 

Приказом Минздрава РФ № 45 от 07.02.2000 г. «О системе мер 

по повышению качества клинических лабораторных исследований в 

учреждениях здравоохранения Российской Федерации» не рекомен-

довано использовать контрольные растворы Hb в качестве калибро-

вочного раствора.

Контрольные растворы Hb не правомочно использовать по сле-

дующим причинам: с контрольным раствором необходимо проводить 

все операции, предусмотренные методикой определения Hb, вслед-

ствие чего неизбежны ошибки при его разведении; его невозможно 

использовать для калибровки приборов, так как это не готовый рас-

твор HbChr, а проба крови, требующая соответствующей обработки 

и подготовки.

В  1998  г.  Пупковой  В.И.  с  соавторами  разработан,  запатен-

тован и внедрен в практику набор реагентов для определения Hb 

гемихромным методом, в состав которого входит концентрат SDS 

(трансформирующий  раствор)  и  калибровочный  раствор  геми-

хрома [31].

Набор зарегистрирован в Российской Федерации и внесен в го-

сударственный  реестр  медицинских  изделий.  Калибровочный  рас-

твор  HbChr  обладает  достаточной  стабильностью  (более  1  года)  и 

обеспечивает высокую точность измерения Hb при l = 540 нм. Соз-

данный калибровочный раствор HbChr соответствует всем требова-

ниям, предъявляемым к калибровочным растворам: это стерильный 

водный раствор, разлитый в ампулы из светозащитного стекла, про-

зрачен, его спектральная чистота: А

533

/А

498

 – в пределах 1,59–1,63; 

А

750

 ≤ 0,002 (при длине оптического пути 10 мм). 

Аттестация  калибровочных  растворов  гемихрома  проводи-

лась  опосредованно  –  относительно  калибровочных  растворов 

HbCN фирм «Boehringer Mannheim» (Германия) и «Ренам» (Рос-

сия).  Калибровочные  растворы  фирмы  «Ренам»  были  аттестова-

ны относительно 6-го Международного калибровочного раствора 

гемиглобинцианида (ICSH) с концентрацией HbCN – 592±1 мг/л 

(систематическая  погрешность  –  0,17%),  изготовленного  в  На-

циональном  институте  общественного  здоровья  и  охраны  окру-

жающей среды, г. Бетховен, Нидерланды. Допустимое значение 

систематической погрешности при аттестации коммерческих ка-

13

либровочных растворов не превышает ±2%, поэтому и результаты 

определения концентрации Hb в одной пробе, полученные обои-

ми методами, сопоставимы: их расхождение также не превыша-

ет ±2%. При теоретическом молярном коэффициенте экстинкции 

HbCN, равном 11,00, молярный коэффициент экстинкции гемих-

рома составляет 10,16.

Контрольные растворы гемоглобина

Использование  калибровочных  растворов  позволяет  точно 

определить концентрацию Hb в крови, если при анализе не было 

допущено  различных  погрешностей.  Погрешности  анализа  мож-

но выявить при внутрилабораторном и межлабораторном контро-

ле качества с помощью контрольных растворов Hb. Контрольные 

растворы  Hb  –  это  высоко  очищенные  имитаторы  крови  челове-

ка, не содержащие примесей, искажающих результаты анализа. 

Систематическая  погрешность,  допускаемая  при  определении 

концентрации  Hb  в  контрольных  растворах,  не  превышает  ±2%. 

Аттестация  этих  растворов  проводится  на  фотометрах  высокого 

класса точности при использовании дозаторов с погрешностью до-

зирования ≤ 1%.

Наличие  наборов  реагентов  для  определения  Hb  в  крови: 

трансформирующего реагента, калибровочных растворов гемихрома 

и контрольных растворов Hb обеспечивает возможность получения 

результатов с погрешностью, не превышающей ±2%. 

Основные достоинства гемихромного метода [13, 32]:

– 

гемихром – стабильное производное гемоглобина, и все имею-

щиеся в крови формы гемоглобина могут быть быстро и количе-

ственно превращены в HbChr;

– 

максимум спектра поглощения HbChr вблизи l = 540 нм (533 нм), 

поэтому достаточная точность анализа возможна при измерении 

оптической плотности на фотоэлектроколориметрах;

– 

растворы HbChr строго подчинены закону Ламберта-Бера при 

l

 = 540 нм в широком диапазоне концентраций; 

– 

калибровочный раствор HbChr устойчив в течение 1,5 лет;

– 

трансформирующий реагент не ядовит и безвреден: в его со-

ставе не содержится цианистых и других токсичных соеди-

нений.

Молярный коэффициент экстинкции HbChr при l = 540 нм ра-

вен 10,16. 

14

Каталог: upload -> iblock
iblock -> Доброкачественная гиперплазия предстательной железы Аденома простаты (дгпж)
iblock -> И. о исполнительного директора
iblock -> Диагностика и лечение отравлений растительными ядами
iblock -> Оценочные средства для текущего контроля успеваемости и промежуточной аттестации Промежуточная аттестация
iblock -> 2016 жылғы № бұйрығына анықтама-негіздеме