Определение аминокислотного состава белков

ученики 10 класса «А»

Владимиров Иван, Шкарупин Максим

Руководители:

К.х.н., доцент Есина Наталья Яковлевна,

Калинина Ольга Николаевна

Используемое оборудование…….…………………………………...………………4

Биуретовая реакция Пиотровского….……………………………………………………..5

Нингидриновая реакция на альфа-аминогруппу…….……………………………………………..……..6

Ксантопротеиновая реакция………………………………………………………………..7

Реакция Миллона на тирозин…………………………………………………………..……8

Реакция Адамкевича на триптофан…………………………………………………..………...9

Реакция Фоля…………..………………………………………….…10

Приложение.……………...………………………………………….11

Вывод……………………….………………………………………..14

Использованная литература……………………...…………………………………….14

Аннотация.

Целью нашей работы является изучение аминокислотного состава белков. Белки – высокомолекулярные азотсодержащие органические соединения, состоящие из аминокислот, соединенных пептидными связями, и имеющие сложную структурную организацию. Так как аминокислоты являются основными структурными элементами белковой молекулы, то их набор и последовательность определяют свойства полимера (белка). Мы рассмотрим это на примере аминокислотного состава белка куриного яйца - альбумина.

В современном мире куры выращиваются в инкубаторах, вследствие чего их рацион достаточно однообразен и несбалансирован. Именно поэтому актуален вопрос: «Есть ли в белке куриного яйца все необходимые человеку аминокислоты?». В процессе данного исследования мы проанализируем биоматериал и дадим ответ на поставленный вопрос.

Давайте сначала разберёмся, что же такое белок. Белок - это макромолекула, состоящая из аминокислот, связанных пептидной связью. Человеку для полноценной жизнедеятельности необходима 21 аминокислота: глицин, аланин, валин, лейцин, изолейцин, серин, треонин, цистин, цистеин, метионин, аспараиновая кислота, аспарагин, глутаминовая кислота, глутамин, лизин, аргинин, фенилаланин, тирозин, триптофан, гистидин, пролин. В процессе изучения альбумина мы с помощью химических реакций выявим наличие некоторых аминокислот в его составе и ответим на вопрос: полезно ли употреблять куриные яйца в пищу?

Качественные (цветные) реакции на функциональные группы белков и аминокислот.

В ходе определения аминокислотного состава белка были использованы апробированные методики.

Биуретовый реактив (содержит NaOH и ионы Cu²⁺), нингидрин (0,5%-ный водный раствор); азотная кислота (концентрированная); гидроксид натрия (20%-ный раствор); реактив Миллона; уксусная кислота (ледяная); серная кислота (концентрированная); ацетат свинца (5%-ный раствор).

Штатив с простыми пробирками; капельницы; пипетки вместимостью 1 мл; водяная баня.

Раствор яичного белка (белок одного куриного яйца отделяют от желтка, растворяют в 20-кратном объеме дистиллированной воды, фильтруют через несколько слоев марли и используют свежеприготовленным); неразбавленный свежий яичный белок; 1%-ные растворы глицина, α-аланина, β-аланина; 0,1%-ные растворы фенилаланина, тирозина, триптофана, гистидина, цистеина гидрохлорида, метионина.

Метод основан на способности пептидной группы белков и полипептидов образовывать в щелочной среде с ионами Cu²⁺ комплексное соединение фиолетового цвета с красным или синим оттенком в зависимости от числа пептидных связей в белке.

В одну пробирку вносят 5 капель раствора яичного белка, в другую – глицина.

Добавляют в каждую пробирку по две капли биуретового реактива, слегка взбалтывают и наблюдают за появлением окрашивания.

При этом, раствор, содержащий белок, окрашивается в интенсивный фиолетовый цвет (пробирка №1), а в пробирке с раствором глицина наблюдается голубое окрашивание, характерное для комплексов меди(II) с аминокислотами (см. рис.1 Приложения).

Таким образом, доказано наличие пептидных связей в альбумине куриного яйца.

2.Нингидриновая реакция на α-аминогруппу.

Метод основан на взаимодействии нингидрина с α-аминогруппой аминокислот, пептидов, белков с образованием окрашенного комплекса синего или сине-фиолетового цвета.

В одну пробирку вносят 5 капель раствора яичного белка, в другую – α-аланина и в третью – β-аланина.

Добавляют в каждую пробирку по 2 капли раствора нингидрина, нагревают до кипения и через 1-3 мин наблюдают появление окрашивания.

Восстановленный нингидрин реагирует с аммиаком и другой молекулой окисленного нингидрина, в результате чего образуется окрашенное соединение – сине-фиолетовый комплекс Руэмана.

При этом, растворы, содержащие белок и α-аланин, окрашиваются в интенсивный фиолетовый цвет (пробирка №1, 2), а в пробирке с раствором β-аланина (пробирка №3) видимых изменений не происходит (см. рис.2,3 Приложения).

Таким образом, доказано наличие α-аминогруппы в альбумине куриного яйца и в α-аланине.

Метод основан на способности аминокислот и аминокислотных остатков полипептидов, содержащих ароматическое кольцо, образовывать при взаимодействии с концентрированной азотной кислотой динитропроизводные соединения желтого цвета. В щелочной среде они переходят в хиноидные структуры, имеющие оранжевое окрашивание.

Ксантопротеиновая реакция характерна для фенилаланина, тирозина и триптофана, имеющих ароматическое (бензольное) кольцо. Эти аминокислоты или содержащие их белки при нагревании с концентрированной азотной кислотой дают нитросоединения желтого цвета.

Ход определения.

В одну пробирку вносят 5 капель раствора яичного белка, в другую – фенилаланина, в третью – тирозина и в четвертую – гистидина.

В каждую пробирку добавляют по 3 капли концентрированной азотной кислоты, нагревают до кипения и наблюдают за появлением окрашивания.

Содержимое пробирок охлаждают под струей водопроводной воды, затем в каждую по каплям добавляют раствор гидроксида натрия, пока не начнется переход окраски.

Во всех пробирках наблюдается появление желтой окраски, переходящей в оранжевую при добавлении NaOH (см. рис.4,5 Приложения).

Таким образом, доказано наличие ароматического кольца во всех исследуемых соединениях.

4.Реакция Миллона на тирозин.

Метод основан на способности тирозина (как свободного, так и входящего в состав белка) при нагревании с реактивом Миллона образовывать ртутную соль нитротирозина, окрашенную в пурпурно-красный цвет.

Эта реакция положительна также для фенольных соединений.

Ход определения.

В одну пробирку вносят 5 капель раствора яичного белка, в другую – тирозина и в третью – фенилаланина. В каждую из них добавляют по 3 капли реактива Миллона и осторожно нагревают на водяной бане (не выше 50˚С), наблюдая за появлением окрашивания.

Наблюдается появление красного окрашивания в пробирках с раствором белка (пробирка №1) и тирозина (пробирка №2), в пробирке с фенилаланином окраска не проявляется (см. рис.6,7 Приложения).

Таким образом, доказано присутствие аминокислоты тирозин в альбумине куриного яйца.

5.Реакция Адамкевича на триптофан.

Метод основан на способности триптофана в кислой среде реагировать с глиоксиловой кислотой с образованием соединения, окрашенного в красно-фиолетовый цвет.

В одну пробирку вносят 2 капли неразбавленного свежего яичного белка, а в другую – раствор триптофана.

Добавляют в каждую из них по 10 капель ледяной уксусной кислоты и осторожно нагревают до растворения выпавшего осадка белка в первой пробирке, после чего содержимое пробирки охлаждают.

Очень осторожно, по стенке добавляют в каждый из растворов около 1 мл концентрированной серной кислоты, не допуская смешивания жидкостей. На границе двух слоев возникает характерное окрашенное кольцо, которое постепенно распространяется по всему объему раствора.

В обеих пробирках в конце эксперимента наблюдалось красное окрашивание (см. рис.8,9 Приложения).

Таким образом, проведена качественная реакция на триптофан и доказано наличие этой аминокислоты в альбумине куриного яйца.

Метод основан на способности белков, в состав которых входят серусодержащие аминокислоты (цистеин, цистин), в щелочной среде при нагревании образовывать сульфид натрия, который с плюмбитом натрия дает черный или бурый осадок сульфида свинца:

Pb(CH₃COO)₂ + 2NaOH → Pb(OH)₂↓+ 2CH₃COONa

Pb(OH)₂↓ + 2NaOH → Na₂[Pb(OH)₄] + 2H₂O

Na₂S + Na₂[Pb(OH)₄] → PbS↓ + 4NaOH

Ход определения.

В три пробирки наливают по 10 капель раствора ацетата свинца и по каплям в каждую из них прибавляют раствор гидроксида натрия до растворения первоначально образующегося осадка. В одну пробирку добавляют 5 капель раствора яичного белка, в другую – цистеина, в третью – метионина, смеси кипятят 1-2 мин и наблюдают за изменением цвета и выпадением осадка.

Наиболее заметное изменение цвета произошло в растворе белка (пробирка №1), в растворе цистеина окраска была не столь интенсиван (пробирка №2), раствор метионина не изменил своей окраски (пробирка №3) (см. рис.10,11 Приложения).

Таким образом, доказано наличие аминокислот, содержащих слабосвязанную серу в альбумине куриного яйца.

Рисунок 1. Биуретовая реакция Пиотровского.

Рисунок 2,3. Нингидриновая реакция на альфа-аминогруппу, до и после эксперимента.

Рисунок 4,5. Ксантопротеиновая реакция, до и после эксперимента.

Рисунок 6,7. Реакция Миллона на тирозин, до и после эксперимента.

Рисунок 8,9,9.1. Реакция Адамкевича на триптофан, до и после проведения эксперимента.

Рисунок 10,11. Реакция Фоля, результат эксперимента.

Химические реакции показали наличие в изучаемом белке фенилаланина, тирозина, триптофана, цистеина и цистина, что подтверждает мысль о том, что употребление куриных яиц в пищу полезно для организма, так как белок содержит аминокислоты, необходимые для нормального функционирования человека.

1. 
   Е.А.Строев, В.Г.Макарова «Практикум по биологической химии». Москва «Высшая школа», 1986.
   
2. 
   В.И.Слесарев «Химия. Основы химии живого». С.-Петербург «Химиздат», 2009.
   
3. 
   Ю.Б.Филллиппович «Основы биохимии». Москва «Агар», 1999.
   
4. 
   Р.Досон, Д.Эллиот, У.Эллиот, К.Джонс «Справочник биохимика». Москва «Мир», 1991.