Если последовательность узнавания находится внутри повторяющихся последовательностей, то появиться отдельный бэнд – полоска на геле в размазанной дорожке
Индивидуальные последовательности в агарозном геле могут узнаваться путем гибридизации по Саузерну
Индивидуальные последовательности в агарозном геле могут узнаваться путем гибридизации по Саузерну
ДНК в геле денатурируется путем инкубации в гидроксиде натрия
ДНК затем переносится на мембрану из специального материала
Это процедура блоттинга
ДНК оказывается на поверхности и таким образом она может свяываться с комплементарными последовательностями
ДНК на мембране затем гибридизуется с короткой последовательностью, называемой пробой
Олиго или поли-нуклеотид, представляющий собой известную последовательность
Олиго или поли-нуклеотид, представляющий собой известную последовательность
Обычно комплементарна какому-то гену
Либо одноцепочечная с самого начала или двухцепочечная и денатурирована перед употреблением
Помечена радиоактивным изотопом фосфора или флюоресцентной меткой
Мембрана пре-гибридизуется с неспецифической ДНК, чтобы заблокировать неспецифические сайты на ДНК
Мембрана пре-гибридизуется с неспецифической ДНК, чтобы заблокировать неспецифические сайты на ДНК
Потом она гибридизуется с пробой
Температура и условия раствора могут быть изменены для наилучшей гибридизации
Одноцепочечная проба находит комплементарную ей ДНК и образует двойную спираль
Несвязанная проба затем отмывается
Радиоактивная проба засвечивает пленку так как она выделяет электроны – бета частицы
Флюоресцентная проба катализирует реакцию, производящую свечение при добавлении субстрата
Проявление пленки дает ауторадиограмму
Полоски (бэнды) на пленке показывают наличие данной рестрикционного фрагмента с последовательностью, комплементарной пробе.
Саузерн блоты
Саузерн блоты
ДНК режется рестриктазами и фрагменты разделяются с помощью электрофореза
Содержимое геля денатурируется и переносится на мембрану
ДНК затем гибридизуется с пробой, комплементарной интересующей нас последовательности
Несвязанная ДНК смывается и мембрана проявляется на фотопленку
Вариация метода с использованием РНК обычно в полиакриламидном геле называется Нозерн (Nothern) блоттинг
Хромосомная ДНК 2х разных людей различается случайными полиморфизмами
Хромосомная ДНК 2х разных людей различается случайными полиморфизмами
Существуют миллионы SSP - single nucleotide polymorphisms
Если эти вариации приводят к созданию или разрушению рестрикционного сайта, то и получившиеся фрагменты будут различаться на Саузерн блотах
Последовательность содержит 2 Eco R1 последовательности, разделенные 4000 нуклеотидов
Последовательность содержит 2 Eco R1 последовательности, разделенные 4000 нуклеотидов
Мутация в одной из 2х хромосом у одного из сравниваемых людей создала новую Eco R1 последовательность внутри исследуемого гена
Получилось 2 фрагмента 1500 and 2500 п.о.
Проба комплементарна к последовательности лежащей внутри последовательности длиной 2500 п.о.
Детекция метод Саузерн блота даст 1 фрагмент 4000 п.о. от нормальной хромосомы и 2 фрагмента от мутантной хромосомы
Используются для сравнения количества РНК в клетке (обычно полиА РНК, т.е. мРНК)
Используются для сравнения количества РНК в клетке (обычно полиА РНК, т.е. мРНК)
Процедура такая же как для Саузерна
РНК должна быть денатурирована до и во время электрофореза, чтобы предотвратить образование вторичных стуктур
Интенсивность бэндов может быть измерена методом денситометрии, что косвенно показывает количество мРНК в клетке
Для чего это нужно знать?
Белки не имеют постоянную величину отношения размера и заряда
Белки не имеют постоянную величину отношения размера и заряда
Метод электрофореза заставляет белки принять постоянные величины размера и заряда
Белковый экстракт, выделенный из клеток, кипятится 3 минуты в растворе детергента SDS и бета меркаптоэтанола, который разрывает дисульфидные связи.
Белковый экстракт, выделенный из клеток, кипятится 3 минуты в растворе детергента SDS и бета меркаптоэтанола, который разрывает дисульфидные связи.
Детергент разрывает третичную и вторичную структуру
Детергент, который имеет негативный заряд, вытягивает и покрывает молекулы белка своим слоем
Таким образом молекулы белка мигрируют в геле от отрицательного полюса к положительному в соответствии со своим размером, который может быть определен с помощью маркеров – см. пример
Измеряют количество специфического белка в геле
Измеряют количество специфического белка в геле
Белки, содержащиеся в полиакриламидном геле, переносятся на мембрану
Проба - антитела
Антитела помечены специальной меткой – например люминесцентной
Интенсивность сигнала показывает уровень экспрессии
В случае мутации белок может получиться короче – в каких случаях?
Приготвление ДНК вставки и вектора (в основном, бактериальной плазмиды)
Приготвление ДНК вставки и вектора (в основном, бактериальной плазмиды)
Обе ДНК режутся рестрикционным ферментом, оставляющим т.н. липкие концы - маленькие участки одноцепочечной гомологичной ДНК
ДНК вводиться в клетки бактерий например если плазмида была бактериальная
Клетки растут и размножаются и соответсвенно увеличивается и количество ДНК
Аналитические цели
Аналитические цели
Последовательность ДНК и структура и функция гена и производного белка могут быть изучены если этот ген изолирован из контекста целого генома и клонирован
Практические цели
Изолированный ген может быть экспрессирован in vivo или in vitro
Коммерческие цели
Терапевтические цели
Примеры?
Манипуляции, чтобы изменить структуру белка
Какие?
Получить много идентичных копий одного и того же гена
Ферменты и буферные растворы
Ферменты и буферные растворы
Рестрикционные ферменты
Лигаза
Иногда в случае клонов кДНК – обратная транскриптаза
Что такое кДНК и зачем она нужна? См. ниже
Векторы
Принимающие клетки
Из бактериального вируса T4
Из бактериального вируса T4
Реакции проходят при пониженной температуре так как этот фермент легко разрушается
Может склеить порезанные концы ДНК
Обычно ДНК нагревают после рестрикции, чтобы денатурировать рестрикционные ферменты и чтобы они больше не резали
Конвертирует ДНК в РНК, чтобы она могда быть клонирована – кДНК
Конвертирует ДНК в РНК, чтобы она могда быть клонирована – кДНК
oligo dT используются как праймеры для обратной транскрипции
ОТ делает одноцепочечную ДНК
РНК затем разрушается специальным ферментом и проводят синтез 2й цепи ДНК
Существуют различные способы
ДНК с независимым ориджином репликации (про- и/или эукариотическим) и маркерами селекции и экспрессии
ДНК с независимым ориджином репликации (про- и/или эукариотическим) и маркерами селекции и экспрессии
Маркер селекции позволяет клетке выжить в летальных условиях, например – в присутствии антибиотиков
Маркер экспрессии позволяет увидеть наличие гена например GFP – green fluorescent protein!
Плазмиды, вирусы или искусственные хромосомы
Уже не используется коммерчески
Уже не используется коммерчески
PBR322 имеет 2 гена устойчивости к антибиотикам
Amp and tet
Есть один сайт узнавания для фермента Bam H1 в гене tet
Клонирование ДНК в этом сайте разрушает ген tet
Могут быть прокариотические и эукариотические
Могут быть прокариотические и эукариотические
Принимают рекомбинантную ДНК
Технические подходы введения ДНК в бактериальные клетки
Полная последовательность кДНК клонирована в дрожжах (простейших эукариотах)
Полная последовательность кДНК клонирована в дрожжах (простейших эукариотах)
Дрожжи – это одноклеточные эукариоты и следовательно они содержат ЭР и сигнальную пептидазу и они были генетически модифицированы, чтобы содержать пептидазу, отрезающюю С-пептид
