Методические рекомендации Москва, 2011 удк ббк


Приготовление 0,01 N AgNO3



бет5/13
Дата19.05.2017
өлшемі1.84 Mb.
#10759
түріМетодические рекомендации
1   2   3   4   5   6   7   8   9   ...   13

Приготовление 0,01 N AgNO3
1,6987 u AgNO3 растворяются в небольшом количестве дис­тиллированной воды, и объем доводится до 100 мл. Получает­ся исходный 0,1 N раствор AgNO3. Из этого раствора гото­вится рабочий 0,01 AgNO3. Для определения правильности приготовления 0,01 AgNO3 проводится проверка его по стан­дартным растворам NaCl.
Приготовление основного стандартного раствора NaCl для определения хлора:

0,659 г дважды перекристаллизованного NaCl растворяют­ся в небольшом количестве воды, и объем доводится до 100мл. Концентрация такого раствора по хлору составляет 400 мг% или 112,4 мэкв/л.


Из исходного раствора готовятся несколько рабочих раст­воров по схеме:

Основной раствор

Дистиллироанная вода

Концентрация хлора

мл

Мл

мг%

Мэкв/л

0,62

9,38

25

7,0

1,25

8,75

50

14,1

2,50

7,50

100

28,2

4,38

5,62

175

49,3

9,12

0,88

365

103,2

Из каждого рабочего раствора берется микропипеткой по 0,1 мл и добавляется дистиллированная вода до 10 мл. К 5 мл каждого полученного раствора добавляют 1—2 капли 10% К2CrO4 и титруют 0,01 N AgNOз до появления кирпично-красного цвета. Расчет по формуле:


Сl (мэкв/л) =

100 x Y

5 x 0,1

где Y — объем AgNOз в мл, пошедшего на титрование. Если полу­ченные результаты в мэкв/л совпадают с представленными в схеме, значит, раствор AgNO3 приготовлен правильно, и его можно использовать для определения хлора в поте больных-детей по описанной выше методике.

Расчет проводится по формуле:




Сl (мэкв/л) =

100 x (Y  Y1)

W x Hч

Где Y  объем AgNO3 мл, пошедшего на титрование пробы, Y1 — объем AgNO3 в мл, пошедшего на титрование 5 мл дистиллированной воды, W — объем взятого на титрование элюата, Нч — навеска пота в граммах.

Навеска пота, используемая для расчетов, должна быть не менее 100 мг. При навесках от 50 до 100 мг увеличивается вероятность получения завышенных цифр, поэтому потовую пробу рекомендуется повторить.


Определение натрия

Определение концентрации натрия в потовой жидкости про­водится на пламенном фотометре. Для этой цели готовятся стандартные растворы NaCl, по которым проводится построе­ние калибровочной кривой или составление таблицы расчетов.


Приготовление основного стандартного раствора для опре­деления Na

254 мг дважды перекристаллизованного NaCl растворяют­ся в 100 мл дистиллированной воды. Из основного раствора готовятся растворы разной концентрации по схеме:



Основной раствор (мл)

Дистиллированная вода (мл)

Концентрация Na

Иа


мг%

мэкв/л

0,25
0,5
1,0

99,75
99,5
99,0

25
50
100

10,9
21,75
43,5

По данным растворам строится калибровочная кривая и составляется таблица. По показаниям пламенного фотометра вычисляется концентрация натрия в миллиэквивалентах для каждой пробы.

Поскольку каждая проба заливается постоянным количест­вом (10 мл) дистиллированной воды, независимо от навески, то при навеске больше 100 мг разведение будет меньше, чем 1:100, а при навеске меньше 100 мг разведение будет боль­ше, чем 1:100. В связи с этим для окончательного расчета при навеске свыше 100 мг миллиэквиваленты нужно разделить на А, где



А =

Навеска пота в мг

100

Если навеска пота меньше 100 мг, то миллиэквиваленты нужно умножить на В, где

B = ↓

100

Навеска в мг

Параллельное определение в потовой жидкости Na и С1 дает более надежные результаты. Разница между концентра­циями Na и Cl в пробе не должна превышать 10 мэкв/л, в противном случае потовая проба повторяется. Повторяется она и при получении концентрации свыше 40 мэкв/л.

При четко налаженной и отработанной методике возмож­но определение только одного из электролитов.


Для выполнения теста необходимо собрать минимум 100 мг пота. Тест должен выполняться квалифицированным и опытным лаборантом. При положительном ответе потовую пробу следует повторить: для окончательного диагностического заключения требуется 2-3 положительные пробы и достоверные клинические доказательства.

Повторное проведение потовой пробы также рекомендуется, если: результаты первого теста сомнительные; результаты первого теста негативные, но клинические проявления позволяют с высокой вероятностью подозревать наличие МВ.



  • Если результаты повторной потовой пробы сомнительны, но сохраняются веские клинические доказательства в пользу МВ или выявляются отдельные симптомы, характерные для МВ (например: стеаторея), рекомендуется проводить терапию, показанную больным с установленным диагнозом МВ. В этих случаях следует периодически повторять потовый тест. Уточнению диагноза может способствовать генетическое тестирование (при условии его доступности).

  • Если не удается получить требуемое количество пота, рекомендуется стимулировать секрецию потовых желез с помощью теплового воздействия, кормления во время сбора пота или физических упражнений. Не следует также забывать о необходимости коррекции дегидратации, если таковая имела место незадолго до проведения потовой пробы. В области отека объем секрета потовых желез может быть сниженным. Повторная стимуляция в одной и той же области может привести к истощению потовых желез, что приводит к повышению концентрации электролитов.

  • Концентрации натрия и хлора в поте обычно примерно одинаковые. Поэтому различия в уровнях натрия и хлора, превышающие 10 ммоль\л, должны настораживать клинициста в отношении возможности технических погрешностей при проведении пробы.

  • Показатели натрия или хлора выше 150 ммоль/л являются не достоверными (Shulz, 1969)

  • У некоторых здоровых новорожденных в первые дни жизни могут отмечаться повышенные концентрации электролитов. Кроме того, сбор пота в этот период часто затруднен. Поэтому рекомендуется проводить потовую пробу не ранее первых 7 дней после рождения, при весе ребенка не менее 3 кг. Некоторые специалисты предпочитают проводить тест детям старше месяца жизни, при возможности с проведением генетического обследования и определения хлоридов пота в динамике.

  • Концентрации натрия и хлора в поте остаются неизменными на протяжении всего детского возраста. После достижения 15-летнего возраста, уровни натрия и хлора в секрете потовых желез здоровых лиц повышаются (иногда до 60-90ммоль\л), но потовая проба в совокупности с клиническим симптомокомплексом сохраняет свое значение для диагностики МВ.

Несмотря на свою специфичность, метод по Гибсону-Куку является длительным, трудоемким и зависит от опыта проводящего персонала. В связи с этим, постоянно ведутся разработки аппаратов, которые позволили бы унифицировать методику, сократить время проведения теста и уменьшить количество пота, необходимое для постановки диагноза.
5.2. Экспресс-методы проведения потового теста. В середине 80-х годов был разработан, внедрен в практику и начал применяться в нашем центре аппарат для скринингового полуколичественного определения хлоридов пота - CF-индикатор американской фирмы «Скандифарм», представлявший собой аппарат с двумя дисками, один из которых пропитан пилокарпином, другой – сульфатом натрия и собственно индикатор для анализа пота. Тест основывался на изменении цвета полоски индикатора. О результате теста судили по центральной его части, где появлялось белое пятно. Отрицательным считался потовый тест, если пятно не выходило за пределы периметра индикаторной области; сомнительным – при совпадении пятна с периметром; положительным, если пятно выходило за его пределы. Несмотря на свою хорошую чувствительность, этот скрининговый метод диагностики МВ не получил широкого распространения и практически не используется в РФ.

Более точными в диагностике МВ признаны экспресс-методы проведения потового теста, основанные на количественном анализе электролитов пота. Так, в Российском центре МВ наряду с «классическим» биохимическим методом (Gibbson, Cooke, 1959 г.) используются экспресс-методы проведения потового теста на аппаратах системы «Macroduct + Sweat Chek», «Nanoduct» фирмы Wescor (США) и «Sanasol-SM-01» (Венгрия).

Система «Macroduct» включает в себя аппарат для ионофореза, который работает от 2-х батарей по 9 Вт каждая, два электрода, накладываемых на предплечье, комплект пилогелевых дисков, коллекторы для сбора пота. Использование пилогелевых дисков в сочетании с автоматическим контролем за ионофорезом в цепи обеспечивает безопасный и эффективный электрофорез пилокарпина. За счет снижения влияния человеческого фактора система «Macroduct» позволяет избегать ошибок, связанных с предварительным сбором пота, выпариванием и конденсацией, что в результате позволяет собрать чистый пот. Объем пота контролируется визуально. Время, необходимое для получения количества потовой жидкости достаточного для постановки потового теста – около 30 минут. Анализатор проводимости «Sweat Chek», который в данной системе является отдельным устройством, отличается надежностью и удобством для специалиста, выполняющего тест, позволяет при объеме пота 6-10 мкл получить абсолютно точный показатель проводимости через несколько секунд после введения предварительно собранной потовой жидкости. К аппарату прилагается набор калибровочных растворов с различной концентрацией и растворов NaСl, проводимость которых эквивалентна 90 ммоль/л. Несмотря на свою высокую надежность, анализатор требует регулярной калибровки, по-нашему мнению, не менее 1 раза в 2 недели.

С 2006 года в Российском и большинстве региональных центров МВ для проведения потовой пробы используется новый для нашей страны прибор «Nanoduct», фирмы Wescor (США). Он объединяет в себе устройство для электрофореза и потовый анализатор (рис.3). Для получения результата необходимо всего 3 мкл пота. Продолжительность потовой пробы составляет около 10 минут, из которых 2,5 минуты – электрофорез. Эта модель разработана для новорожденных и детей первых месяцев жизни, но может использоваться в любом возрасте.

В отличие от классического – биохимического метода Гибсона-Кука, которым определяется непосредственно концентрация ионов хлора в поте обследуемого больного, работа потовых анализаторов «Sweat-Chek» и «Nanoduct» основана на измерении проводимости ионов пота, называемой «эквивалентной» концентрацией хлорида натрия. Результат измерений, получаемый в ммоль/л означает, что данный потовый образец имеет проводимость, эквивалентную проводимости раствора хлорида натрия с концентрацией, равной показаниям прибора. Так как проводимость определяется совокупностью всех ионов, присутствующих в потовой жидкости (калий, натрий, хлор, бикарбонат, аммоний и др.), полученный результат превышает истинную концентрацию хлоридов примерно на 15-20 ммоль/л. В связи с этим, в качестве позитивных для муковисцидоза рассматриваются результаты выше 80 ммоль/л, показатели 60-80 ммоль/л считаютс пограничными, а до 60 ммоль/л – нормальными (табл. 8). Показатели проводимости выше 170 ммоль/л должны быть подвергнуты сомнению.

Таблица 8. Интерпретация результатов потового теста.

РЕЗУЛЬТАТ (ммоль/л)

НОРМА


ПОГРАНИЧНЫЙ


ПОЛОЖИТЕЛЬНЫЙ


Классический метод (по Гибсону-Куку)

< 40

40-60

>60

Определение проводимости (Макродакт, Санасол, Нанодакт)

< 60

60-80

>80

Среди всех детей, обследованных нами с помощью системы «Macroduct» и анализатора «Sweat-Chek», 5% составили пациенты с МВ, проводимость пота которых равнялась 60-80 ммоль/л, 2,5% - больные МВ с проводимостью менее 60 ммоль/л. Диагноз МВ у всех этих больных был верифицирован на основании совокупности данных, включая результаты классического потового теста и ДНК-диагностику. Мы полагаем, что в этих случаях можно говорить об атипичной форме МВ с пограничным и даже нормальным содержанием хлоридов в поте. Многолетняя мировая практика использования анализатора «Sweat-Chek» в диагностике МВ, результаты многочисленных исследований по сопоставлению данной методики с классическим методом определения концентрации хлоридов в потовой жидкости свидетельствуют о том, что измерение проводимости пота является столь же эффективным методом диагностики МВ, как и определение концентрации хлоридов.

По принципу определения проводимости ионов работает потовый анализатор модели “SM-01” производства фирмы Sanasol Meditechnika, Венгрия (рис.4). В Российском центре муковисцидоза этот анализатор используется с 2002 года. Данный аппарат объединяет в себе устройство для ионофореза и анализатор. Измерение проводится в закрытой системе, используя 1 µл пота. Также как и анализатор Sweat-Chek аппарат Sanasol пригоден для работы вне лаборатории. Нормы для него аналогичны нормативным показателям для «Sweat-Chek» и «Nanoduct».

Ложно-негативные и ложно-позитивные результаты потового теста.

Наиболее частые причины ложно-негативных результатов: технические ошибки, тестирование новорожденных в первые дни жизни, проведение потовой пробы пациентам с безбелковыми отеками (по ликвидации отеков потовая проба становится положительной), гипопротеинемией, а также при лечении антибиотиком Клоксациллин.

«Ложноположительный» тест можно получить у больных с целым рядом заболеваний. Однако, большинство из этих состояний имеет весьма характерную клинику, и частота их в популяции невелика.

В таблице 6 (см. выше) уже перечислены состояния, в ряде случаев сопровождающиеся повышением содержания хлоридов пота. Следует помнить, что подобные ситуации встречаются крайне редко, а положительная потовая проба является высоко специфичным тестом для диагностики МВ.


5.3. Разность назальных потенциалов. При проведении потовой пробы могут встречаться пограничные, а также в небольшом проценте случаев как ложноположительные, так и ложноотрицательные значения. В связи с этим, возникает необходимость в дополнительных, более чувствительных диагностических тестах. Одним из таких тестов является измерение трансэпителиальной разницы назальных электрических потенциалов. Впервые метод измерения разности назальных потенциалов (РНП) был предложен Knowles M.R. в 1981 году для объективной оценки эффективности генной терапии при МВ [5]. Он представляет собой измерение разности электрических потенциалов между относительным электродом в контакте с предплечьем и измеряющим электродом на поверхности слизистой дна нижнего носового хода. Такая локализация была выбрана не случайно. Респираторный эпителий при МВ является критическим местом, где реализуются процессы нарушения ионного транспорта. За счет отсутствия или снижения ц-АМФ-зависимой секреции ионов хлора Cl- и гиперабсорбции ионов Na+ формируется трансэпителиальная разность электрических потенциалов, которая является измеряемым параметром. В связи с трудностями определения трахеобронхиальной разности назальных потенциалов, местом измерения была выбрана слизистая носа, а именно, дно нижнего носового хода. В данном участке фиксируется максимальная РНП, коррелирующая с высоким (до 78%) процентом реснитчатых клеток (Knowles M.R. с соавт.). К технике проведения пробы предъявляются определенные требования: 1) отсутствие ОРВИ, полипов и травм носовой полости на момент проведения исследования, 2) должен учитываться максимальный стабильно регистрируемый показатель обеих половин носа. Дети младшего возраста могут негативно реагировать на постановку подкожного катетера и продвижение электрода в полость носа, что затрудняет проведение у них данного исследования. В связи с этим данный диагностический метод на практике применяется в основном у детей старше 6-7 лет и взрослых. В норме пределы разности потенциалов колеблются от –5 mV до –40 mV; у больных МВ эти пределы составляют от –40 mV до –90 mV.
5.4. Генетическое тестирование. ДНК анализ на все возможные мутации, связанные с МВ, нереален, так как число известных мутаций уже превышает 1600. Частота каждой из этих мутаций варьирует в широких пределах. Ряд авторов полагает, что если ни одна из 10 наиболее часто встречающихся в данном регионе мутаций не обнаруживается ни в одной из хромосом пациента вероятность диагноза МВ значительно снижается.
5.5. Неонатальный скрининг. Одним из практически важных подходов к сокращению количества больных (в отдаленной перспективе) является скрининг новорожденных. Скрининг на МВ, как национальная программа пока ограничен небольшим числом стран, хотя планируется его масштабное внедрение в большинстве развитых стран. Это связано с одной стороны с огромными затратами на лечение данного контингента больных, а с другой, с очевидными преимуществами групп больных МВ, диагностированных с помощью скрининга. Имеется положительный опыт его применения в ряде стран Западной Европы и Северной Америки. В США по инициативе фонда муковисцидоза (CFF) рекомендовано включение муковисцидоза в скрининговую программу во всех штатах, так как более чем 20-тилетний опыт его применения в ряде развитых стран (Новая Зеландия, Австралия, Италия, Франция) и некоторых штатах США убедительно доказывает его пользу. Так в Бретани (Франция) частота МВ в течение 20 лет снизилась в 2 раза, в восточной Англии – на одну треть.

Благодаря внедрению в 2007-2008 гг., программы неонатального скрининга на МВ в Великобритании и России, число детей, прошедших массовое обследование возросло с полутора до трех миллионов в год.

По данным ряда исследователей скрининг на МВ оправдан потому, что


  1. Ранняя диагностика муковисцидоза у детей позволяет своевременно осуществлять адекватные лечебно-реабилитационные мероприятия, что положительно отражается как на состоянии больных, так и на средней продолжительности их жизни).

  2. Раннее выявление больных муковисцидозом дает возможность как медико-генетического консультирования, так и дородовой ДНК-диагностики в информативных и перспективных семьях.

  3. Скрининг позволяет определить частоту муковисцидоза в разных регионах страны и/или этнических группах, что важно для планирования объема лечебно-профилактической помощи этой категории больных.

  4. Проведение его в течение ряда лет позволит в перспективе уменьшить количество больных МВ в стране.

  5. Заболевание в группе больных, выявленных с помощью неонатального скрининга, протекает более благоприятно.

  6. Скрининг снижает стоимость диагностики и лечения МВ.

В настоящее время в Европе насчитывается около 26 вариантов программ неонатального скрининга, включающих от 2 до 4 последовательных этапов обследования. Наибольшее распространение нашли такие схемы как ИРТ/ИРТ, ИРТ/ДНК, ИРТ/ДНК/ИРТ. Схема наиболее часто используемой в странах Запада программы скрининга новорожденных выглядит следующим образом. На первом этапе в высушенном пятне крови с помощью диагностического набора оценивают содержание иммунореактивного трипсина (ИРТ). Концентрации ИРТ в крови новорожденных, страдающих МВ, почти в 5-10 раз превосходят уровни ИРТ у здоровых детей этого возраста. Для измерения концентрации ИРТ высушенные пятна крови новорожденных исследуют с помощью радиоиммунного или ферменто-связанного анализа (ELISA или ФСА). Этот тест является весьма чувствительным (85-90%), но не специфичным в отношении МВ. Последнее связано с тем, что причиной гипертрипсиногенемии в неонатальном периоде помимо МВ могут быть внутриутробная гипоксия плода, внутриутробные инфекции, перинатальный стресс, коньюгационная желтуха новорожденных, хромосомные аберрации (трисомии 13 и 18 хромосом), врожденная почечная недостаточность, атрезия тонкого кишечника, а также нефрогенный несахарный диабет. Границы между ложно-позитивными и ложно-негативными результатами узкие — < 10%. Образцы с повышенным содержанием ИРТ направляют на ДНК-типирование с целью обнаружения мутаций в гене МВТР. При выявлении 1 или 2 мутаций результаты скрининга считаются положительными и, больной направляется в Центр муковисцидоза для верификации диагноза. Если мутации не выявлены, а содержание ИРТ в крови высокое, проводят потовую пробу. Позитивный потовый тест у таких лиц так же расценивают как положительный результат скрининга, и больные направляются в Центр муковисцидоза. В качестве теста второго уровня (дополнительного маркера скрининга МВ) изучается возможность использования белка, ассоциированного с панкреатитом (PAP). Были определены пороговые значения концентрации РАР (норма ≤ 8 нг/мл) в периферической крови новорожденных группы риска по МВ и разработаны комбинированные наборы для оценки уровня РАР или ИРТ + РАР. По мнению ряда авторов, использование РАР в качестве биохимического маркера скрининга на МВ является альтернативой ДНК диагностики. С одной стороны, этот тест экономически более выгоден, чем проведение анализа ДНК, с другой – позволяет избежать проблем, связанных с необходимостью получения информированного согласия от родителей ребенка на проведение исследования, что имеет место при ДНК-диагностике в большинстве европейских стран. К тому же, использование дополнительного маркера, возможно, приведет к снижению доли ложноотрицательных результатов скрининга.

С 2006 г. в ряде регионов, а с первого января 2007 г. во всех субъектах Российской Федерации (РФ) МВ был включен в перечень наследственных заболеваний (наряду с фенилкетонурией, галактоземией, гипотиреозом и адреногенитальным синдромом), подлежащих обязательному неонатальному скринингу в рамках национального приоритетного проекта «Здоровье». В настоящее время в нашей стране скрининг проводится в 4 этапа (табл.9).




Достарыңызбен бөлісу:
1   2   3   4   5   6   7   8   9   ...   13




©stom.tilimen.org 2022
әкімшілігінің қараңыз

    Басты бет