Приготовление 0,01 N AgNO3

0,659 г дважды перекристаллизованного NaCl растворяют­ся в небольшом количестве воды, и объем доводится до 100мл. Концентрация такого раствора по хлору составляет 400 мг% или 112,4 мэкв/л.

Расчет проводится по формуле:

Навеска пота, используемая для расчетов, должна быть не менее 100 мг. При навесках от 50 до 100 мг увеличивается вероятность получения завышенных цифр, поэтому потовую пробу рекомендуется повторить.

Определение концентрации натрия в потовой жидкости про­водится на пламенном фотометре. Для этой цели готовятся стандартные растворы NaCl, по которым проводится построе­ние калибровочной кривой или составление таблицы расчетов.

254 мг дважды перекристаллизованного NaCl растворяют­ся в 100 мл дистиллированной воды. Из основного раствора готовятся растворы разной концентрации по схеме:

Поскольку каждая проба заливается постоянным количест­вом (10 мл) дистиллированной воды, независимо от навески, то при навеске больше 100 мг разведение будет меньше, чем 1:100, а при навеске меньше 100 мг разведение будет боль­ше, чем 1:100. В связи с этим для окончательного расчета при навеске свыше 100 мг миллиэквиваленты нужно разделить на А, где

При четко налаженной и отработанной методике возмож­но определение только одного из электролитов.

Повторное проведение потовой пробы также рекомендуется, если: результаты первого теста сомнительные; результаты первого теста негативные, но клинические проявления позволяют с высокой вероятностью подозревать наличие МВ.

• 
  Если результаты повторной потовой пробы сомнительны, но сохраняются веские клинические доказательства в пользу МВ или выявляются отдельные симптомы, характерные для МВ (например: стеаторея), рекомендуется проводить терапию, показанную больным с установленным диагнозом МВ. В этих случаях следует периодически повторять потовый тест. Уточнению диагноза может способствовать генетическое тестирование (при условии его доступности).
  
• 
  Если не удается получить требуемое количество пота, рекомендуется стимулировать секрецию потовых желез с помощью теплового воздействия, кормления во время сбора пота или физических упражнений. Не следует также забывать о необходимости коррекции дегидратации, если таковая имела место незадолго до проведения потовой пробы. В области отека объем секрета потовых желез может быть сниженным. Повторная стимуляция в одной и той же области может привести к истощению потовых желез, что приводит к повышению концентрации электролитов.
  
• 
  Концентрации натрия и хлора в поте обычно примерно одинаковые. Поэтому различия в уровнях натрия и хлора, превышающие 10 ммоль\л, должны настораживать клинициста в отношении возможности технических погрешностей при проведении пробы.
  
• 
  Показатели натрия или хлора выше 150 ммоль/л являются не достоверными (Shulz, 1969)
  
• 
  У некоторых здоровых новорожденных в первые дни жизни могут отмечаться повышенные концентрации электролитов. Кроме того, сбор пота в этот период часто затруднен. Поэтому рекомендуется проводить потовую пробу не ранее первых 7 дней после рождения, при весе ребенка не менее 3 кг. Некоторые специалисты предпочитают проводить тест детям старше месяца жизни, при возможности с проведением генетического обследования и определения хлоридов пота в динамике.
  
• 
  Концентрации натрия и хлора в поте остаются неизменными на протяжении всего детского возраста. После достижения 15-летнего возраста, уровни натрия и хлора в секрете потовых желез здоровых лиц повышаются (иногда до 60-90ммоль\л), но потовая проба в совокупности с клиническим симптомокомплексом сохраняет свое значение для диагностики МВ.
  

Более точными в диагностике МВ признаны экспресс-методы проведения потового теста, основанные на количественном анализе электролитов пота. Так, в Российском центре МВ наряду с «классическим» биохимическим методом (Gibbson, Cooke, 1959 г.) используются экспресс-методы проведения потового теста на аппаратах системы «Macroduct + Sweat Chek», «Nanoduct» фирмы Wescor (США) и «Sanasol-SM-01» (Венгрия).

Система «Macroduct» включает в себя аппарат для ионофореза, который работает от 2-х батарей по 9 Вт каждая, два электрода, накладываемых на предплечье, комплект пилогелевых дисков, коллекторы для сбора пота. Использование пилогелевых дисков в сочетании с автоматическим контролем за ионофорезом в цепи обеспечивает безопасный и эффективный электрофорез пилокарпина. За счет снижения влияния человеческого фактора система «Macroduct» позволяет избегать ошибок, связанных с предварительным сбором пота, выпариванием и конденсацией, что в результате позволяет собрать чистый пот. Объем пота контролируется визуально. Время, необходимое для получения количества потовой жидкости достаточного для постановки потового теста – около 30 минут. Анализатор проводимости «Sweat Chek», который в данной системе является отдельным устройством, отличается надежностью и удобством для специалиста, выполняющего тест, позволяет при объеме пота 6-10 мкл получить абсолютно точный показатель проводимости через несколько секунд после введения предварительно собранной потовой жидкости. К аппарату прилагается набор калибровочных растворов с различной концентрацией и растворов NaСl, проводимость которых эквивалентна 90 ммоль/л. Несмотря на свою высокую надежность, анализатор требует регулярной калибровки, по-нашему мнению, не менее 1 раза в 2 недели.

С 2006 года в Российском и большинстве региональных центров МВ для проведения потовой пробы используется новый для нашей страны прибор «Nanoduct», фирмы Wescor (США). Он объединяет в себе устройство для электрофореза и потовый анализатор (рис.3). Для получения результата необходимо всего 3 мкл пота. Продолжительность потовой пробы составляет около 10 минут, из которых 2,5 минуты – электрофорез. Эта модель разработана для новорожденных и детей первых месяцев жизни, но может использоваться в любом возрасте.

В отличие от классического – биохимического метода Гибсона-Кука, которым определяется непосредственно концентрация ионов хлора в поте обследуемого больного, работа потовых анализаторов «Sweat-Chek» и «Nanoduct» основана на измерении проводимости ионов пота, называемой «эквивалентной» концентрацией хлорида натрия. Результат измерений, получаемый в ммоль/л означает, что данный потовый образец имеет проводимость, эквивалентную проводимости раствора хлорида натрия с концентрацией, равной показаниям прибора. Так как проводимость определяется совокупностью всех ионов, присутствующих в потовой жидкости (калий, натрий, хлор, бикарбонат, аммоний и др.), полученный результат превышает истинную концентрацию хлоридов примерно на 15-20 ммоль/л. В связи с этим, в качестве позитивных для муковисцидоза рассматриваются результаты выше 80 ммоль/л, показатели 60-80 ммоль/л считаютс пограничными, а до 60 ммоль/л – нормальными (табл. 8). Показатели проводимости выше 170 ммоль/л должны быть подвергнуты сомнению.

Таблица 8. Интерпретация результатов потового теста.

РЕЗУЛЬТАТ (ммоль/л)	НОРМА	ПОГРАНИЧНЫЙ	ПОЛОЖИТЕЛЬНЫЙ
Классический метод (по Гибсону-Куку)	< 40	40-60	>60
Определение проводимости (Макродакт, Санасол, Нанодакт)	< 60	60-80	>80

Среди всех детей, обследованных нами с помощью системы «Macroduct» и анализатора «Sweat-Chek», 5% составили пациенты с МВ, проводимость пота которых равнялась 60-80 ммоль/л, 2,5% - больные МВ с проводимостью менее 60 ммоль/л. Диагноз МВ у всех этих больных был верифицирован на основании совокупности данных, включая результаты классического потового теста и ДНК-диагностику. Мы полагаем, что в этих случаях можно говорить об атипичной форме МВ с пограничным и даже нормальным содержанием хлоридов в поте. Многолетняя мировая практика использования анализатора «Sweat-Chek» в диагностике МВ, результаты многочисленных исследований по сопоставлению данной методики с классическим методом определения концентрации хлоридов в потовой жидкости свидетельствуют о том, что измерение проводимости пота является столь же эффективным методом диагностики МВ, как и определение концентрации хлоридов.

По принципу определения проводимости ионов работает потовый анализатор модели “SM-01” производства фирмы Sanasol Meditechnika, Венгрия (рис.4). В Российском центре муковисцидоза этот анализатор используется с 2002 года. Данный аппарат объединяет в себе устройство для ионофореза и анализатор. Измерение проводится в закрытой системе, используя 1 µл пота. Также как и анализатор Sweat-Chek аппарат Sanasol пригоден для работы вне лаборатории. Нормы для него аналогичны нормативным показателям для «Sweat-Chek» и «Nanoduct».

Ложно-негативные и ложно-позитивные результаты потового теста.

Наиболее частые причины ложно-негативных результатов: технические ошибки, тестирование новорожденных в первые дни жизни, проведение потовой пробы пациентам с безбелковыми отеками (по ликвидации отеков потовая проба становится положительной), гипопротеинемией, а также при лечении антибиотиком Клоксациллин.

«Ложноположительный» тест можно получить у больных с целым рядом заболеваний. Однако, большинство из этих состояний имеет весьма характерную клинику, и частота их в популяции невелика.

В таблице 6 (см. выше) уже перечислены состояния, в ряде случаев сопровождающиеся повышением содержания хлоридов пота. Следует помнить, что подобные ситуации встречаются крайне редко, а положительная потовая проба является высоко специфичным тестом для диагностики МВ.

Благодаря внедрению в 2007-2008 гг., программы неонатального скрининга на МВ в Великобритании и России, число детей, прошедших массовое обследование возросло с полутора до трех миллионов в год.

По данным ряда исследователей скрининг на МВ оправдан потому, что

1. 
   Ранняя диагностика муковисцидоза у детей позволяет своевременно осуществлять адекватные лечебно-реабилитационные мероприятия, что положительно отражается как на состоянии больных, так и на средней продолжительности их жизни).
   
2. 
   Раннее выявление больных муковисцидозом дает возможность как медико-генетического консультирования, так и дородовой ДНК-диагностики в информативных и перспективных семьях.
   
3. 
   Скрининг позволяет определить частоту муковисцидоза в разных регионах страны и/или этнических группах, что важно для планирования объема лечебно-профилактической помощи этой категории больных.
   
4. 
   Проведение его в течение ряда лет позволит в перспективе уменьшить количество больных МВ в стране.
   
5. 
   Заболевание в группе больных, выявленных с помощью неонатального скрининга, протекает более благоприятно.
   
6. 
   Скрининг снижает стоимость диагностики и лечения МВ.
   

В настоящее время в Европе насчитывается около 26 вариантов программ неонатального скрининга, включающих от 2 до 4 последовательных этапов обследования. Наибольшее распространение нашли такие схемы как ИРТ/ИРТ, ИРТ/ДНК, ИРТ/ДНК/ИРТ. Схема наиболее часто используемой в странах Запада программы скрининга новорожденных выглядит следующим образом. На первом этапе в высушенном пятне крови с помощью диагностического набора оценивают содержание иммунореактивного трипсина (ИРТ). Концентрации ИРТ в крови новорожденных, страдающих МВ, почти в 5-10 раз превосходят уровни ИРТ у здоровых детей этого возраста. Для измерения концентрации ИРТ высушенные пятна крови новорожденных исследуют с помощью радиоиммунного или ферменто-связанного анализа (ELISA или ФСА). Этот тест является весьма чувствительным (85-90%), но не специфичным в отношении МВ. Последнее связано с тем, что причиной гипертрипсиногенемии в неонатальном периоде помимо МВ могут быть внутриутробная гипоксия плода, внутриутробные инфекции, перинатальный стресс, коньюгационная желтуха новорожденных, хромосомные аберрации (трисомии 13 и 18 хромосом), врожденная почечная недостаточность, атрезия тонкого кишечника, а также нефрогенный несахарный диабет. Границы между ложно-позитивными и ложно-негативными результатами узкие — < 10%. Образцы с повышенным содержанием ИРТ направляют на ДНК-типирование с целью обнаружения мутаций в гене МВТР. При выявлении 1 или 2 мутаций результаты скрининга считаются положительными и, больной направляется в Центр муковисцидоза для верификации диагноза. Если мутации не выявлены, а содержание ИРТ в крови высокое, проводят потовую пробу. Позитивный потовый тест у таких лиц так же расценивают как положительный результат скрининга, и больные направляются в Центр муковисцидоза. В качестве теста второго уровня (дополнительного маркера скрининга МВ) изучается возможность использования белка, ассоциированного с панкреатитом (PAP). Были определены пороговые значения концентрации РАР (норма ≤ 8 нг/мл) в периферической крови новорожденных группы риска по МВ и разработаны комбинированные наборы для оценки уровня РАР или ИРТ + РАР. По мнению ряда авторов, использование РАР в качестве биохимического маркера скрининга на МВ является альтернативой ДНК диагностики. С одной стороны, этот тест экономически более выгоден, чем проведение анализа ДНК, с другой – позволяет избежать проблем, связанных с необходимостью получения информированного согласия от родителей ребенка на проведение исследования, что имеет место при ДНК-диагностике в большинстве европейских стран. К тому же, использование дополнительного маркера, возможно, приведет к снижению доли ложноотрицательных результатов скрининга.

С 2006 г. в ряде регионов, а с первого января 2007 г. во всех субъектах Российской Федерации (РФ) МВ был включен в перечень наследственных заболеваний (наряду с фенилкетонурией, галактоземией, гипотиреозом и адреногенитальным синдромом), подлежащих обязательному неонатальному скринингу в рамках национального приоритетного проекта «Здоровье». В настоящее время в нашей стране скрининг проводится в 4 этапа (табл.9).