Материалы и методы

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

Мы взяли уже парафинированные в специальных формах образцы мозга крысы и убедившись, что это подходящий экземпляр, закрепили на подставку для резки на микротоме. Срезы толщиной в 5 мкм изготавливали на санном микротоме Leica SR-2000R. Каждый пригодный для изучения срез переносили на специально подготовленные стекла. Для их фиксации использовали дистиллированную воду с добавлением 1% альбумина. Затем для депарафинирования опускали препараты в ксилол и последовательно проводили по спиртам нисходящей концентрации (этиловый спирт 100% → 96% → 80% →60%). Для отмывки от остатков спирта, стекла помещали в дистиллированную воду.

Иммуногистохимия – группа методов окраски биологического материала в условиях сохранения морфологии клеток, позволяющих определить расположение антигена в различных тканях с помощью специфических антител и чувствительных систем детекции.

Метод иммуногистохимии основан на том, что антитела (иначе – иммуноглобулины), вырабатываемые В-лимфоцитами животных, способны связываться с определенными участками белковых молекул (антигенов). Чтобы получить антитела к изучаемому белку у животного вызывают иммунный ответ, после чего сыворотку крови очищают и выделяют из нее нужные антитела. В настоящее время для получения антител используется гибридомная технология, которая основана на культивировании клеточных линий вырабатывающих нужные антитела.

Для выявления глиального кислого фибриллярного белка использовали АВС-метод (Avidin – Biotin Complex). Биотин (витамин Н) – соединение, выдерживающее высокие температуры, а также устойчивое в кислой и щелочной среде. Хорошо растворимо в воде и спиртах. Биотин легко может вступать в соединение с различными белками, в том числе с ферментами. В большом количестве он содержится в белке птичьих яиц, где он связан с гликопротеином авидином. Такой комплекс очень крепкий, но разрушить его можно при термической обработке.

Авидин имеет 4 места связывания, к которым можно присоединить биотин или белки, таким образом биотин-авидин комплекс можно использовать как мостик между антителами и ферментами. При этом три центра связывания авидина соединены через биотин с ферментом, а четвертый остаётся свободным. Этот комплекс образуется в три этапа[№5,стр.22]:

1) Немеченые первичные тела соединяются с антигеном

2) Меченые биотином вторичные антитела соединяются с первичными

3) Добавляется комплекс авидин-биотин-фермент, который присоединяется к биотину вторичных тел.

Затем добавляют комплекс авидин-биотин-фермент. Так, с одной молекулой антигена оказываются связаны три молекулы фермента.

Для того чтобы выявить фермент (в нашем случае это пероксидаза, получаемая из корней хрена), используют различные цветные реакции, окрашенные продукты которых осаждаются в месте где находится выявляемый антиген. Пероксидаза раззлагает перекись водорода с образованием воды и атомарного кислорода. Для выявления пероксидазы цветной реакцией будет образование темного окрашенного соединения из 3,3-диаминобензидина под действием кислорода, выделяемого при разложении перекиси водорода.

В нашей работе применение иммуногистохимического метода позволяет отделить астроциты от других элементов мозга, благодаря их специфическому маркеру – GFAP.

Использованные реактивы:

1. Антитела к кислому глиофибриллярному белку (GFAP), выработанные в кролике (G9269, Sigma) – первичные антитела.

2. Биотинилированные антитела козы к иммуноглобулинам кролика и авидипероксидазу (Sigma, набор EXTRA-3 KIT) - «система детекции»

3. Раствор хромогена для окрашивания состоял из 3,3-диаминобензидин (0,05%) с хлоридом никеля (0,1%). In situ готовили смесь раствора хромогена (5 мл) и 50 мкл 3% перекиси водорода.

Срезы депарафинировали в ксилоле и проводили по спиртам нисходящей концентрации до воды.

Перед инкубацией срезы были обработаны 0,1% раствором перекиси водорода на протяжении 10 минут. После чего срезы промывали буферным раствором (0,01M фосфатно-солевой буфер, pH=7,2).

Первичные антитела для выявления GFAP разводили на фосфатно-солевом буфере, содержащем 1% бычьего сывороточного альбумина, в соотношении 1: 200.

На каждый срез наносили раствор первичных антител в объеме 70 мкл и инкубировали стекла со срезами во влажной камере в течение ночи при комнатной температуре.

После чего срезы промывали буферным раствором и наносили раствор вторичных антител, в разведении 1:80, и выдерживали срезы 5 часов.

После инкубации срезы вновь промывали и наносили раствор авидинпероксидазы (1:80), выдерживали срезы два часа и промывали, после чего наносили раствор хромогена и наблюдали за развитием окраски. Через три-пять минут срезы помещали в воду, проводили по спиртам возрастающей концентрации и помещали в ксилол. После чего срезы заключали под покровное стекло в акриловую смолу DPX.
Метод окрашивания препаратов по Нисслю.

Основу метода Ниссля составляет способность с помощью красителей выявлять, содержащийся в цитоплазме нервных клеток нуколеопротеиновый комплекс (субстанция Ниссля). Этот метод позволяет выявить ядра и тела нервных клеток, а также позволяет определить типы глиальных клеток по характеру их ядер. Данный метод не выявляет отростки глиальных клеток.

Нами был использован следующий способ окраски по Нисслю – срезы, после иммуногистохимической реакции на GFAP, помещали в дистиллированную воду, а затем переносили в 0.1% водный раствор крезилового фиолетового, контролируя окраску на взгляд, не допуская сильного перекрашивания препаратов. После раствора красителя срезы проводили последовательно по спиртам восходящей концентрации. Срезы заключали в синтетическую акриловую смолу и покрывали покровным стеклом. После просушивания препараты подвергались исследованию.
Микрофотосъемка и анализ изображений.

Съёмку препаратов осуществляли на микроскопе Leica DMLB, оснащенном цифровой камерой, при увеличении объектива в 10х и 40х.

Исходная фотография.	«Маска», полученная в результате выделения контура астроцитов	Результат компьютерной обработки. Показаны объекты для анализа и подсчета: Зеленым — остов астроцита. Фиолетовым — концевые точки отростков. Красным — точки ветвления отростков.