Лекция 9 Лекция 10 Автоматическое секвенирование Определение первичной структуры ДНК



Pdf көрінісі
Дата18.08.2018
өлшемі108.05 Kb.
түріЛекция

Геном

2

500 знаков/стр, 



400 стр/книгу

10

6



знаков/книгу

Плазмиды -

10



- 10



4

Вирусы -


10

3

- 10



4

Митохондрии и

Хлоропласты - 10

4

- 10



5

ПРОКАРИОТЫ - 10

5

- 10


6

ЭУКАРИОТЫ

Дрожжи -

10

7



Животные -

10

8



- 10

9

Растения -



10

9

- 10



11

Лекция 9


Лекция 10

Автоматическое

секвенирование

Определение

первичной

структуры ДНК

In January 2012, Life Technologies 

introduced a sequencer to decode a 

human genome in one day for $1,000



Автоматический синтез ДНК

Гибридизационная диагностика генов

с флуоресцентными метками

Массовый анализ

на микрочипах

Анализ на хромосомах


С 2000 по 2009 гг число

людей, живущих с

ВИЧ

в

Восточной Европе и



Центральной Азии, 

увеличилось

почти в три

раза. 


В 2009 г, по оценкам, это

число достигло 1,4 млн

чел (т.е. 1 из неск 100), в

2000 г оно было 0,53

В мире насчитывается

от 31 до 35 

миллионов ВИЧ-

инфицированных



Получение ДНК

П

олимеразная цепная реакция (ПЦР)



Кэрри Маллис

Нобелевская премия

по химии 1993 г.


Double 

strand cDNA



AAAAA

TTTTT


RT

AAAAA

TTTTT


RT

RT

AAAAA

TTTTT


Oligo dT primer is 

bound to 

mRNA

Reverse 


transcriptase (RT) 

copies first 

cDNA

strand


Reverse 

transcriptase 

digests and 

displaces mRNA 

and copies second 

strand of cDNA

Копирование мРНК в кДНК обратной транскриптазой


A. Double 

strand DNA

B. Denature

96º


50º

C. Anneal 

primers

50º


D. Polymerase 

binds


72º

Taq

Taq

72º

Taq

Taq

E. Copy 


strands

1

2



3

4

F. 



Denature

96º


First round 

of cDNA 


synthesis (4 

strands)


Taq

Taq

1

2

3



4

50º


G. Anneal 

primers


1

2

3



4

Taq

Taq

Taq

Taq

72º


H. 

Polymerase 

binds


1

2

3



4

Taq

Taq

Taq

Taq

I. Copy 


strands

72º


Second 

round of 

cDNA 

synthesis (8 



strands)

1

2

3



4

J. 


Denature at 96º

Anneal primers at 

50º


1

2

3



4

72º


K. Bind polymerase 

(not shown) and copy 

strands

Third 


round of 

cDNA 


synthesis 

(16 


strands)

1

2

3



4

L. 


Denature at 96º

Anneal primers at 

50º


1

2

3



4

M. 


Copy strands at 

72º


Fourth 

round of 

cDNA 

synthesis 



(32 

strands)


72º

1

2

3



4

cDNA 


strands (32) 

are now 


shown as 

lines


1

2

3



4

After 5 rounds 

there are 32 

double strands of 

which 24 (75%) are 

are same size



Эндонуклеазы

рестрикции II

(рестриктазы)

гидролизуют

ДНК

по определенным



участкам

Полиморфизм длины

рестрикционных фрагментов (ПДРФ)‏



Полиморфизм длины

рестрикционных фрагментов

(ПДРФ)‏

Сэр Алек Джеффрис, 1985



Дактилоскопия ДНК

Идентификация личности

Идентификация родства

Идентификация царской семьи

Инцест Египетских фараонов

Кто была Ева и откуда она

Неандертальцы и Homo sapiens

Полиморфизм

тандемных

повторов (STR)

1998

CODIS:


Combined DNA

Index System



Где родилась Ева?

В Мемфисе, Вавилоне или Мохенджо-Даро?

В Мемфисе, Африка


Рекорды дактилоскопии ДНК

2006 г. 


идентификация

ДНК


через

33 тыс лет



Что такое клонирование?

Клонирование: 

- живого объекта (организма, клеток), 

- неживого объекта (ДНК) – жаргон!

Клон –

генетически



идентичное

потомство одной

клетки

(одного организма) 



КЛОНИРОВАНИЕ – точное воспроизведение

живого объекта в нескольких копиях... 

Все «копии» должны обладать идентичной

наследственной информацией, 

т.е. нести

идентичный набор генов

Генетики получают клоны размножением



партеногенезом, т.е. бесполым путем, 

без предшествующего оплодотворения. 

Естественное клонирование человека –

феномен однояйцевых близнецов. 

Л.И. Корочкин

Клонирование ДНК – жаргон!



ЭКО

25 июля 1978 г.

Louise Brown 

30 лет – 4 млн

Не путать

с “Репродуктивной медициной”



The Nobel Prize in 

Physiology or Medicine 

2010

Robert G. Edwards

University of Cambridge, 

UK

"for the development of 



in vitro fertilization”

Не путать

с “Пре-имплантационной

диагностикой и естественным терапевтическим

“клонированием”

Естественное

выращивание

генетически

недефектного

брата (сестры) 

для пересадки

органа

(костный мозг) 



генетически

дефектному

родственнику

Молли и Адам Нэш

с родителями

окт. 19, 2000

авг (рожд) 

Клетки НЕ разбирают

на компоненты и детей НЕ убивают!


Пересадка

ядер


и

клонирование

“Don’t clone

humans!”


Science

2001, 291, 2552



Цикл III 

Генотип и фенотип

8. Регуляция, передача сигнала (рак) 

9. Геном, плазмиды, вирусы (ВИЧ) 

10. Генетическая инженерия (ГМО)


Дополнительная литература

www.issep.rssi.ru



Конструирование

рекомбинантных ДНК



Генная инженерия -

4/5 основных этапа

In vitro

(в пробирке) 

1.

1. Получение генов (ПЦР) 



2.

1’. Выбор вектора

2. Получение рекомбинантных ДНК

In vivo


(в клетке) 

3. Введение рек. ДНК в клетку

(трансформация) 

4. Отбор целевых клеток (скрининг)

Библиотеки генов 


Этап 1. Получение ДНК

П

олимеразная цепная реакция (ПЦР)



Кэрри Маллис

Нобелевская премия

по химии 1993 г.


Этап 2. Векторная ДНК

Вектор для прокариот

Получение

рекомбинантных

ДНК


Искусственная мини-хромосома

Стрелка показывает

на искусственную

мини-хромосому,

которая

функционирует



как натуральная

(голубая)

Может служить

мега-вектором

для клонирования

ДНК


Этап 3. Трансформация -

введение ДНК в клетку

Физические:

Слияние мембран:

Микроинъекция

Липосомы


Электропорация

Рецепторный

Эндоцитоз

Биобаллистика

(W, Au – 0,1 мкм) 

Химические:

- Ca

2+ 


Рекомбинантные вирусы (?) 

-

Аденовирус



-

Герпеса


-

ВИЧ


Этап 4 

«Клонирование

ДНК»


ИДЕНТИФИКАЦИЯ КЛОНОВ

с рекомбинантной ДНК

при помощи зонда


Гены флуоресцентных белков медузы

работают в бактериях



Трансгенные организмы

(ГМО, ГМП)‏

Цель введения нового гена в клетку:

-

Замена дефектного гена для восстановления функции



-

Новый ген для изменения фенотипа

(новые свойства)‏

- Новый ген для продукции новых веществ

(клеточные фабрики или фабрики - организмы)‏

Делеция гена в клетке

-

Генетический нокаут (ДНК)‏



-

Генетический нокдаун (мРНК)‏



Рекомбинантные белки, 

разрешенные для лечения человека

БЕЛОК

ЗАБОЛЕВАНИЕ



Вакцины

Моноклональные антитела

Антигемофильный фактор

Гемофилия

Гормон роста

Дефицит у детей

ДНКаза I

Муковисцидоз

Инсулин

Сахарный диабет



Интерлейкин

Рак почки

Интерфероны

Множественный эффект

Тканевый активатор

плазминогена

Острый инфаркт миокарда

(тромболитик)

Острая обширная эмболия

легочной артерии

Эритропоэтин

Анемия, заболевания почек



Получение

трансгенных

растений

устойчивость к

неблагоприятным

факторам и

полезные

потребительские

свойства


Получение

трансгенных

животных


Гены флуоресцентных белков медузы

работают в животных

Химера из белка клетки (раковый белок) 

и

флуоресцентного белка



Нобелевская премия по

химии 2008

Osamu Shimomura

Martin Chalfie

Roger Y. Tsien

for the discovery and 

development of the green 

fluorescent protein, GFP 



Генотерапия

Только: соматические клетки конкретного пациента

замена дефектного гена на нормальный


Генотерапия

14.09.1990

Бетезда, НИЗ, США

дефект аденозиндезаминазы

(иммунодефицит) 


Генетический контроль и

биологическая безопасность

Межведомственная комиссия по проблемам генно-

инженерной деятельности МВКГИД (www.iacgea.ru) 





История важнейших открытий

1901- Ландштейнер открыл группы крови, начало переливания крови



1906 - первая пересадка трупной роговицы

1910 - Томас Морган открыл хромосомы - органеллы наследственности



1926 - Меллер открыл мутагенные эффекты радиации и химических веществ

1912- Бантинг и Бест открыли инсулин и причину диабета



1936 - первые ферменты получены в кристаллическом состоянии

1944 - Осваль Эвери и Маклин МакКарти доказали, что изолированная ДНК встраивается в геном бактерий, изменяя их



фенотип

1904 - Нобелевская премия в области физиологии и медицины присуждена Ивану Петровичу Павлову за открытие



условных рефлексов

1951 - первая операция коронарного шунтирования (коронарный байпасс) 



1953 - Джеймс Уотсон и Френсис Крик открыли двойную спираль ДНК

1955 - первая пересадка почки



1956 - первая коронарная ангиопластика

1961 - Маршалл Ниренберг расшифровал генетический код



1961 - первые пересадки гематогенных стволовых клеток для спасения обреченных пациентов

1964 - Чарлз Яновский подтвердил линейное соответствие генов и белков бактерий



1967 - первая пересадка сердца и печени

1969 - группа исследователей из Гарвардской медицинской школы изолировала первый ген человека



1974 - Стенли Коэн и Герберт Бойер пересадили ген лягушки в

бактериальную клетку. Начало генной инженерии



1976 - создана первая биотехнологическая компания Genentech; начались пересадки генов человека в клетки

микроорганизмов для промышленной наработки инсулина, интерферона и других полезных белков

1980 - Мартин Кляйн создал первую трансгенную мышь путем пересадки гена человека в оплодотворенную яйцеклетку



мыши

1982 - генно-инженерный инсулин, наработанный бактериями, разрешен для использования в медицине



1983 - открыта полимеразная цепная реакция (техника многократного клонирования коротких цепей ДНК) - стало

возможным синхронно изучать работу многих генов

1985 - техника "генетической дактилоскопии" ДНК стала использоваться в мировой криминалистике



1985 - первые пересадки фетальной нервной ткани для лечения болезни Паркинсона

1988 - выдан первый патент на генетически модифицированное животное



1990 - начало работ по международному проекту Геном Человека

1997 - клонировано первое млекопитающее - овца по кличке Долли; затем последовали удачные эксперименты по



клонированию мышей и других млекопитающих

1997-1998 - изолирование эмбриональных стволовых клеток человека в виде бессмертных линий



1998 - создание методов одновременной регистрации активности 1000-2000 генов в геноме человека и млекопитающих



1999-2000 - полная расшифровка генома 10 бактерий, дрожжей. 



Document Outline

  • Геном
  • Автоматическое секвенирование Определение первичной структуры ДНК
  • Автоматический синтез ДНК
  • Гибридизационная диагностика генов с флуоресцентными метками
  • Получение ДНК Полимеразная цепная реакция (ПЦР) 
  • Эндонуклеазы рестрикции II (рестриктазы) гидролизуют ДНК по определенным участкам
  • Полиморфизм длины рестрикционных фрагментов (ПДРФ)‏
  • Полиморфизм длины рестрикционных фрагментов (ПДРФ)‏
  • Дактилоскопия ДНК
  • Где родилась Ева? В Мемфисе, Вавилоне или Мохенджо-Даро?
  • Рекорды дактилоскопии ДНК
  • Что такое клонирование?
  • КЛОНИРОВАНИЕ – точное воспроизведение живого объекта в нескольких копиях... Все «копии» должны обладать идентичной наследстве
  • ЭКО 25 июля 1978 г. Louise Brown 30 лет – 4 млн
  • Не путать с “Пре-имплантационной  диагностикой и естественным терапевтическим “клонированием”  
  • Пересадка ядер и клонирование “Don’t clone humans!” Science 2001, 291, 2552
  •  Цикл III Генотип и фенотип
  • Дополнительная литература
  • Конструирование рекомбинантных ДНК
  • Генная инженерия - 4/5 основных этапа 
  • Этап 1. Получение ДНК Полимеразная цепная реакция (ПЦР) 
  • Этап 2. Векторная ДНК
  • Вектор для прокариот
  • Получение рекомбинантных ДНК
  • Искусственная мини-хромосома
  • Этап 3. Трансформация - введение ДНК в клетку
  • Этап 4 «Клонирование ДНК»
  • ИДЕНТИФИКАЦИЯ КЛОНОВ с рекомбинантной ДНК   при помощи зонда
  • Гены флуоресцентных белков медузы   работают в бактериях
  • Трансгенные организмы (ГМО, ГМП)‏
  • Рекомбинантные белки, разрешенные для лечения человека
  • Получение трансгенных растений устойчивость к неблагоприятным факторам и полезные потребительские свойства
  • Получение трансгенных животных
  • Гены флуоресцентных белков медузы работают в животных
  • Нобелевская премия по химии 2008
  • Генотерапия
  • Генотерапия 
  • Генетический контроль и биологическая безопасность



Достарыңызбен бөлісу:


©stom.tilimen.org 2019
әкімшілігінің қараңыз

    Басты бет