К. В. Дмитрук, В. Ю. Яцишин, А. Я. Вороновський, Д. В. Федорович, А. А. Сибірний



Pdf көрінісі
Дата03.09.2018
өлшемі81.24 Kb.
#84382

70

Наука та інновації. 2009. Т. 5. № 6. С. 70—74. 

© К.В. ДМИТРУК, В.Ю. ЯЦИШИН,

    А.Я. ВОРОНОВСЬКИЙ, Д.В. ФЕДОРОВИЧ,

    А.А. СИБІРНИЙ, 2009



К.В. Дмитрук, В.Ю. Яцишин,

А.Я. Вороновський, Д.В. Федорович, А.А. Сибірний

Інститут біології клітини НАН України, Львів



КОНСТРУЮВАННЯ НАДПРОДУЦЕНТІВ РИБОФЛАВІНУ

(ВІТАМІНУ В

2

) ДРІЖДЖІВ CANDIDA FAMATA

Шляхом введення додаткових копій гена позитивного регулятора біосинтезу рибофлавіну (РФ) у геном раніше 

селекціонованих штамів дріжджів Candida famata, здатних до надсинтезу РФ, отримано стабільні дріжджові штами-

надпродуценти вітаміну В

2

. Підібрано оптимальні середовища та умови культивування для максимального виходу 

цільового продукту — РФ.

К л ю ч о в і   с л о в а: рибофлавін (вітамін В

2

), дріжджі, Candida famata, надсинтез, штами-продуценти.

Рибофлавін (РФ) є одним із найважливі-

ших ростових факторів людини і тварин. До-

бова потреба людини у вітаміні В

2

 складає 



приблизно 2 мг. Дефіцит вітаміну В

2

 виникає 



при інтенсивному рості організму, при вагіт-

ності, після тривалого лікування антибіотика-

ми.

 РФ успішно застосовується при лікуванні 



мігрені та малярії [1]. 

Надзвичайно важливою 

передумовою росту тварин та птахів є достат-

ня забезпеченість кормів вітаміном В

2

. Дефі-


цит РФ у кормових раціонах веде до порушен-

ня обміну речовин, затримки росту, погіршен-

ня засвоєння амінокислот і жирів, послаблен-

ня зору, дерматозів, зниження продуктивності 

і використання поживних речовин у кормах та 

їжі. Введення РФ у склад преміксів, комбікор-

мів і кормосумішей для тварин і птиці підви-

щує їх приріст, покращує виживання молод-

няка, збільшує продуктивність, знижує затра-

ти кормів на одиницю продукції. 

В Україні виробництво препаратів РФ від-

сутнє. У світі виробляється близько 6,5 тис. 

тон РФ. Приблизно 60 % загального виробни-

цтва РФ використовується в сільсь ко му гос-

подарстві як додаток до кормів, решта 40 % — 

в медицині як компонент полівітамінних сумі-

шей та лікарських препаратів 

[

2, 3



]

. РФ про-

тягом десятків років синтезують хімічним спо-

собом. Проте в останні роки спостерігається 

заміщення хімічного синтезу РФ біотехноло-

гічним із застосуванням аскоміцет ного гри ба 



Ashbya gossypii, генно-інженерних шта мів бак-

терії Bacillus subtilis та дріжджів Candida famata 

[

4, 5, 6, 7



]

Мікробний синтез дозволяє заоща-

дити майже половину коштів, зменшити енер-

гетичні затрати та уникнути забруднення на-

вколишнього середовища 

[8]

.

Позитивним у виробництві РФ з викорис-



танням дріжджів є здатність цих мікроорганіз-

мів рости на простих живильних середовищах, 

напівпродуктах та відходах харчової промис-

ловості. Крім того, дріжджова біомаса є цін-

ним джерелом збалансованого за амінокис-

лотним складом кормового білка. Серйозним 

недоліком промислового штаму C. famata, який 

використовувався американською біотехноло-

гічною фірмою Archer Daniels Midland, є його 


71

Наука та інновації. № 6, 2009



Науково-технічні інноваційні проекти Національної академії наук України

генетична нестабільність і реверсія до штамів, 

які втрачають здатність до надсинтезу вітамі-

ну В


2

. Створення стабільних дріжджових про-

дуцентів із підвищеною ефективністю синтезу 

РФ дасть можливість налагодити прибуткове 

виробництво препаратів цього вітаміну.

У наших попередніх дослідженнях 

[9] 

було 


ідентифіковано та клоновано ген SEF1, що ко-

дує позитивний регулятор біосинтезу РФ 

дріжджів  C. famata. З’ясовано, що цей меха-

нізм регуляції біосинтезу РФ є універсальним 

для інших видів дріжджів, здатних до надсин-

тезу вітаміну В

2

. У даній роботі представлено 



конструювання високопродуктивного стабіль-

ного дріжджового штаму — продуцента РФ — 

шляхом введення додаткових копій гена SEF1 

та підбір умов для ефективної продукції віта-

міну В

2

.



МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ

Дріжджі вирощували у колбах та пробірках 

у багатому середовищі YPD (глюкоза — 20 г/л; 

пептон — 10 г/л; дріжджовий екстракт — 5 г/л), 

мінімальному середовищі Беркгольдера (саха-

роза — 20 г/л; (NH

4

)

2



SO

4

 — 3 г/л або сечовина —



1 г/л; KH

2

PO



4

 — 0,5 г/л; MgSO

4

·7H


2

O — 0,2 г/л; 

CaCl

2

·6H



2

O — 0,2 г/л; біотин — 1 мкг/л; мікро-

елементи (0,5 мл/л): B

3+

 — 0,01 мг/л, Cu



2+

 — 


0,01 мг/л, Mn

2+

 — 0,01 мг/л, Mo



4+

 — 0,01 мг/л, 

Zn

2+

 — 0,07 мг/л) та в промислових середови-



щах різного складу на качалці (200 об./хв.) при 

28  °С протягом 2—6 діб. Для засіву викорис-

товували 1—2-добову культуру дріжджів, ви-

рощену на агаризованому YPD.

Біомасу дріжджів визначали турбідиметрич-

ним методом на концентраційному фотоелек-

тричному колориметрі КФК-2МП (λ = 540 нм, 

кювета — 3 мм), розраховуючи суху вагу за ка-

лібрувальною кривою. Вміст флавінів у куль-

туральній рідині визначали флуорометрично 

на флуорометрі Turner Quantech Digital Fiiter 

Flu o rometere FM109510-33, використовуючи 

як стандарт синтетичний РФ.

Електротрансформацію дріжджів С. famata 

проводили, як описано раніше 

[10]


. Виділення 

сумарної ДНК із клітин С. famata здійснюва-

ли за допомогою комерційного набору DNea-

sy® Tissue Kit (Qiagen, Німеччина). Виділен-

ня та очистку плазмідної ДНК, підготовку та 

трансформацію компетентних клітин E. coli, 

елек трофорез ДНК в агарозному гелі, елюцію 

фрагментів ДНК з агарозного гелю, розщеп-

лен ня ДНК рестриктазами, дефосфорилюван-

ня “липких” кінців ДНК, ліґування лінеаризо-

ваних фрагментів ДНК, ампліфікацію фрагмен-

тів ДНК за допомогою полімеразної ланцюго-

вої реакції (ПЛР) здійснювали згідно з 

[11]


При ампліфікації фрагментів ДНК за допомо-

гою ПЛР використовували синтетичні оліго-

нуклеотидні праймери фірми “IDT Tech no lo-

gies” (США).

РЕЗУЛЬТАТИ ТА ОБГОВОРЕННЯ

Конструювання стабільного надсинтетика 

РФ полягало у введенні додаткової копії гена 

SEF1 Debaryomyces hansenii у геном штаму AF4 

C. famata, селекціонованого в нашій лаборато-

рії за допомогою класичного мутагенезу ко-

лекційного штаму C. famata ВКМ Y-9, та ви-

користанні селективних середовищ 

[12]

.

 Від-



бір флавіногенного штаму методами класичної 

селекції включав 6 етапів. Як мутаген вико-

ристовували ультрафіолет, нітрозогуанідин та 

етилметансульфонат.

 

Протягом кожного ета-



пу селекції перевіряли здатність відібраних 

флавіногенних мутантів до росту в середови-

щі з етанолом як єдиним джерелом вуглецю 

та енергії і відбирали для подальшого покра-

щення лише ті штами, які здатні утилізувати 

етанол. Це давало можливість уникнути не без -

пеки реверсії флавіногенних штамів за оз на кою 

здатності рости на етанолі, що корелює у про-

мислового продуцента РФ, штаму ATCC 20849, 

із втратою здатності до надсинтезу

 

вітаміну В



2

Найбільш флавіногенним се 



ред перевірених 

виявився штам AF4, що наг ро маджував до 688 

мг РФ/л за 4 доби ку ль тивування в колбах на 

круговій качалці при 200 об./хв.

Для ведення в геном мутанта AF4 додатко-

вої копії гена SEF1 D. hansenii його трансфор-



72

Наука та інновації. № 6, 2009



Науково-технічні інноваційні проекти Національної академії наук України

мували плазмідою 

pTDhSEF



[9]



що містила, 

окрім

 гена 


SEF1, ген ble Staphylococcus aureus, 

котрий забезпечує резистентність до флеомі-

цину

.

 Відбирали штами, здатні до росту на се-



лективному середовищі, і за допомогою ПЛР 

підтверджували наявність у них плазміди.

Нами було відібрано штам AF4/SEF1

,

 який 



нагромаджує при вирощуванні в колбах у цук-

рово-мінеральному середовищі більше 1 г РФ/л 

(див. рисунок). Цей штам отримав назву Can-

di da  famata  IMB Y-5034 

[12]


. Продуктивність 

фла віногенезу (кількість утвореного РФ в пе-

рерахунку на одиницю біомаси) сконструйова-

ного штаму C. famata IMB Y-5034 на 3-ю добу 

культивування у 3 рази вища, ніж у вихідного 

штаму C. famata AF4. Продуктивність біосин-

тезу РФ у промислового штаму C. famata АТСС 

20849 при вирощуванні у такому ж середовищі 

не перевищує 30 мг РФ/г біомаси.

Проведено аналіз стабільності за ознакою 

«надсинтез РФ» у отриманого штаму. Як конт-

ро льні були використані штами C. famata IMB 

Y-5033 та AF4. Частота реверсії для раніше 

отриманого штаму — надсинтетика РФ C. fa-



ma ta IMB Y-5033 становить 13,8 × 10

–6 


, а шта-

му AF4 — 0,4 × 10

–6

. Сконструйований штам C. 



famata IMB Y-5034 характеризується високою 

стабільністю: після 14 днів культивування він 

не утворює

 

нефлавіногенних клонів, здатних 



до утворення білих, великих за розміром, ко-

лоній при рості на середовищі з етанолом. 

З метою підвищення флавіногенної актив-

ності отриманого рекомбінантного штаму в 

його геном було введено другу додаткову ко-

пію гена SEF1 дріжджів D. hansenii. Введення 

генетичної інформації у геном реципієнта ви-

магає селективного маркера, завдяки якому 

можна відібрати відповідні рекомбінантні шта-

ми. Для цього було сконструйовано плазміду, 

яка містить новий домінантний селекційний 

маркер для C. famata — ген IMH3 D. hansenii, що 

кодує інозинмонофосфат дегідрогеназу і визна-

чає стійкість до мікофенолової кислоти 

[13].

Сконструйованою плазмідою трансформува-



ли кращий наявний штам — продуцент РФ C. fa-

mata IMB Y-5034 (AF4/SEF1). З окремих ко-

лоній отриманих трансформантів виділяли 

сумарну ДНК та аналізували її за допомогою 

ПЛР-аналізу на наявність селективного марке-

ра — гена IMH3. В результаті було відібрано 

штам AF4/2хSEF1, в геномі якого міститься 

щонайменше дві копії гена SEF1 D. hansenii. У 

штаму AF4/2хSEF1 визначали рівень синтезу 

РФ та вираховували продуктивність флавіно-

генезу. Виявлено, що за продуктивністю синте-

зу РФ сконструйований штам перевищує ви-

хідний штам AF4/SEF1 на 25% (див. рисунок).

Було досліджено флавіногенну активність 

низки рекомбінантних штамів, похідних AF4, 

які містили додаткову копію гена SEF1, при 

вирощуванні у середовищах різного складу 

(табл. 1). Найкращий ріст та нагромадження 

РФ дослідженими рекомбінантними штамами — 

похідними AF4, які містили додаткову копію 

гена  SEF1, — забезпечувало середовище, що 

містило 0,5 % дріжджового екстракту. Макси-

мальний вихід РФ (більше 1 г/л) спостерігав-

ся на 5-у добу вирощування. При цьому про-

дуктивність флавіногенезу штамів, що місти-

ли додаткову копію гена SEF1, була в 2,5 рази 

вищою, ніж у штаму-реципієнта AF4.

Продуктивність флавіногенезу штамів AF4, AF4/SEF1, 

AF4/2xSEF1



73

Наука та інновації. № 6, 2009



Науково-технічні інноваційні проекти Національної академії наук України

Нагромадження РФ в культурі залежало від 

джерела азоту. Максимальний вихід РФ для 

штаму № 12 (AF4/SEF1) отримано при виро-

щуванні в середовищі, що містило 0,5 % дріж-

джового екстракту та 0,1 % сечовини — 1377 

мг/л (табл. 2). Флавіногенна активність штаму 

№ 12 (AF4/SEF1) була нижчою при викорис-

танні відходів та напівпродуктів харчової про-

мисловості (браги, сусла, меляси) та діамонію 

фосфату у різних співвідношеннях. Для реком-

бінантного штаму AF4/2хSEF1, що містить дві 

копії гена SEF1, максимальний вихід РФ спо-

стерігався і при вирощуванні в середовищі, що 

містило 0,5 % дріжджового екстракту.

Було досліджено також вплив концентрацій 

окремих компонентів середовища на синтез РФ 

сконструйованими штамами з викорис тан ням ме-

тодів математичного планування ек 

спериментів 

(аналіз Плакета–Бермана). Додавання до середо-

вища на 50 % вищої концентрації сахарози, іонів 

марганцю, кобальту та цинку приводило до зрос-

тання  флавіногенезу на 25, 20, 11 та 6 % відповід-

но. Підвищені концентрації іонів калію, заліза та 

міді знижують флавіногенну активність досліджу-

ваних тран с формантів на 9–17 %.

ВИСНОВКИ

За допомогою методів класичної та молеку-

лярної генетики нами було сконструйовано шта-

ми-продуценти РФ, які мають втричі вищу про-

дуктивність біосинтезу вітаміну В

2

 внаслідок 



введення додаткових копій гена позитивного ре-

гулятора біосинтезу РФ SEF1 у геном раніше се-

лекціонованого штаму, здатного до надсинтезу 

РФ. Підібрано умови максимального виходу ці-

льового продукту — РФ при вирощуванні скон-

струйованих штамів у лабораторних умовах. 

От римані штами мають найвищу продуктив-

ність флавіногенезу з усіх відомих на сьогодні 

дріжджових надсинтетиків РФ.

Таблиця 1

Флавіногенна активність рекомбінантних штамів  (похідних AF4), які містять додаткову копію гена SEF1,

вирощених у середовищах різного складу (5 діб вирощування)

Штам


СБ

СБ + 0,5% YE

YPD

Біомаса, 



мг/мл

РФ

Біомаса, 



мг/мл

РФ

Біомаса, 



мг/мл

РФ

мг/л



мг/г

мг/л


мг/г

мг/л


мг/г

AF4


1,23

107,7


87,6

5,93


528,6

89,1


7,16

375,8


52,5

№ 1


1,36

281,1


207,2

5,71


1176,8

206,2


3,37

464,4


137,6

№ 8


1,17

267,0


228,8

5,27


1189,9

225,9


5,08

909,3


179,1

№ 11


0,91

279,6


305,7

4,95


930,4

187,9


5,74

698,4


121,7

№ 12


0,88

277,1


313,7

5,49


1210,4

220,6


5,20

600,2


115,3

Таблиця 2

Нагромадження РФ (мг) штамом № 12 (AF4/SEF1) C. famata у середовищах

із різними джерелами азоту

Органічне джерело

Неорганічне джерело

Немає


(NH

4

)



2

SO

4



 0,3 %

(NH


4

)

2



HPO

4

 



0,3 %

Сечовина 0,1 %

YE, 0,5 %

958,9


1295,5

1173,1


1377,1

Пептон, 0,2 %

326,4

754,9


622,3

999,7


Сусло зернове, 1 %

7,5


262,7

242,1


652,9

Немає


149,4


40,6

469,2


74

Наука та інновації. № 6, 2009



Науково-технічні інноваційні проекти Національної академії наук України

Згідно з договором між Інститутом біології 

клітини НАН України і ЗАТ «Ладижин» Він-

ницької обл., який передбачає  масштабування 

культивування продуцента, розпочато опрацю-

вання технології промислового виробництва та 

очистки препарату вітаміну В

2

. Забезпечення 



високих виходів біомаси при вирощуванні у 

ферментерах дасть змогу налагодити економіч-

но вигідне виробництво вітаміну В

2

.



ЛІТЕРАТУРА

1.  Powers H.J. Riboflavin (vitamin B-2) and health // Amer. 

J. Clin. Nutr.  2003. — Vol. 77.  P. 1352—1360.

2.  Vandamme E.J., Soetaert W. 2006. Personal care products 

via fermentation and biocatalysis processes. In: Biotech-

nology in Personal Care. Lad, R. (ed.). New York, USA: 

Taylor and Francis. — Р. 27—56.

3.  Sanchez S., Demain A. Metabolic regulation and overpro-

duction of primary metabolites // Microbial Biotechnol-

ogy. — 2008. — Vol. 1, № 4. — P. 283—319.

4.  Stahmann K.P., Revuelta J.L., Seulberger H. Three bio-

technical processes using Ashbya gossypii, Candida fa-



ma ta, or Bacillus subtilis compete with chemical ribofla-

vin production // Microbiol. and Biotechnol. — 2000. — 

Vol. 53, № 5 — P. 509—516.

5.  Lim S.H., Choi J.S., Park E.Y. Microbial Production of Ri-

boflavin Using Riboflavin Overproducers, Ashbya gossypii

Bacillus subtilis, and Candida famate: An Overview // Bio-

technol. Bioprocess Eng. — 2001. — Vol. 6. — P. 75—88.

6.  Сибірний А.А., Федорович Д.В., Борецький Ю.Р., Воро-

новський А.Я. Мікробний синтез флавінів. Київ: Нау-

кова думка, 2006. — 253 с. 

7.  Survase S.A., Bajaj I.B., Singhal R.S. Biotechnological 

Pro duction of Vitamins // Food Technol. Biotechnol. — 

2006. — Vol. 44, № 3. — P. 381—396.

8.  Karos M., Vilarino C., Bollschweiler C., Revuelta J.L. A ge-

nome-wide transcription analysis of a fungal riboflavin 

overproducer // J. Biotechnol. — 2004. — Vol. 113. — P. 69—

76.

9.  Dmytruk K.V., Voronovsky A.Y., Sibirny A.A. Insertion mu-



tagenesis of the yeast Candida famata (Debaryomy ces ha-

nsenii) by random integration of linear DNA frag ments // 

Curr. Genet. — 2006. — Vol. 50, № 3. — P. 183–191.

10. Voronovsky A, Abbas C.A., Fayura L.R. et al. Development 

of a transformation system for the flavinogenic yeast. 



Candida famata  // FEMS Yeast Res. — 2002. Vol. 2,

№ 3. — P. 381–388.

11. Sambrook J., Fritsh E.F., Maniatis T. Molecular Cloning: A 

La boratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold 

Spring Harbor, New York. 1989.

12. Патент  України на корисну модель № 36164 від 

10.10.2008 р., бюл. № 19.

13. Hyle J.W., Shaw R.J., Reines D. Functional distinctions 

bet ween IMP dehydrogenase genes in providing my co-

phenolate resistance and guanine prototrophy to yeast // 



J. Biol. Chem. — 2003. — Vol. 278, № 31. — P. 28470—

28478.


К.В. Дмитрук, В.Ю. Яцишин,

А.Я. Вороновский, Д.В. Федорович, А.А. Сибирный

КОНСТРУИРОВАНИЕ СВЕРХПРОДУЦЕНТОВ 

РИБОФЛАВИНА (ВИТАМИНА В

2

)



ДРОЖЖЕЙ CANDIDA FAMATA

Путем введения дополнительных копий гена позитив-

ного регулятора биосинтеза рибофлавина (РФ) в геном 

селекционированных ранее штаммов дрожжей Can dida 



famata, способных к сверхсинтезу РФ, получены ста-

бильные дрожжевые штаммы-сверхпродуценты витами-

на  В

2

. Подобраны оптимальные среды и условия ку ль-



тивирования для максимального выхода целевого про-

дукта — РФ.



К л ю ч е в ы е   с л о в а: рибофлавин (витамин В

2

), дрож-



жи, Candida famata, сверхсинтез, штаммы-продуценты.

K.V. Dmytruk, V.Y. Yatsyshyn,

A.Y. Voronovsky, D.V. Fedorovych, A.A. Sibirny

CONSTRUCTION OF RIBOFLAVIN (VITAMIN B

2

)

 



OVERPRODUCERS OF THE YEAST

CANDIDA FAMATA 

The stable riboflavin (RF) overproducers were isolated 

by means of amplification of the gene encoding positive reg-

ulator of RF synthesis into selected earlier C. famata flavi-

nogenic strains. The medium components and cultivation 

conditions were optimized for maximal accumulation of 

product (RF). 

K e y   w o r d s: riboflavin (vitamin B

2

), yeast, Candida fa-



ma ta, oversynthesis, overproducers.

Надійшла до редакції 17.04.09.





Достарыңызбен бөлісу:




©stom.tilimen.org 2022
әкімшілігінің қараңыз

    Басты бет