Изучение необратимой тепловой денатурации белков методом дифференциа льной


Значения энергии активации одностадийной денатурации



Pdf көрінісі
бет2/3
Дата24.07.2018
өлшемі390.58 Kb.
1   2   3

Значения энергии активации одностадийной денатурации,

определенные разными способами

А.Е.Любарев, Б.И.Курганов

58

Таким образом, мы видим общую тенденцию к снижению



значений удельной энергии активации с увеличением молекулярной

массы белка. Трудно сказать, имеет ли данная тенденция физичес

кий смысл. Не следует забывать, что мы имеем дело с кажущимися

значениями энергии активации. Ни для одного из приведенных в

табл. 1 белков нет строгих доказательств того, что процесс денату

рации проходит в одну стадию. Более того, для некоторых белков

очевидно, что это не так (см. раздел IV). Приведенные в таблице

кажущиеся значения могут существенно отличаться от истинных

значений энергии активации для стадии разворачивания белковой

молекулы. Вероятно, с увеличением размера белка увеличивается

число стадий денатурации, либо увеличивается скорость стадий,

следующих за разворачиванием, что приводит к уменьшению

кажущегося значения энергии активации.

Следует обратить внимание на тот факт, что для большинства

белков, данные о которых приведены в табл. 1, значения энтальпии

денатурации оказались больше значений энергии активации. Если

предполагать, что процесс денатурации носит истинно одностадий

ный характер, такое соотношение означает, что энергия активации

обратного процесса должна быть отрицательной, т.е. константа ско

рости ренатурации должна уменьшаться с ростом температуры.

Такая возможность обсуждается в работе [6]. Тем не менее более

правдоподобным нам представляется предположение о том, что дена

турация описанных белков имеет многостадийный характер, а рас

считанные значения энергии активации характеризуют одну из на

чальных стадий процесса, которая является скорость–лимитирующей.

ОПИСАНИЕ  С ПОМОЩЬЮ ОДНОСТАДИЙНОЙ МОДЕЛИ

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ДАННЫХ,

ПОЛУЧЕННЫХ ДРУГИМИ МЕТОДАМИ

В ряде работ для изучения тепловой денатурации белка исполь

зовались, помимо ДСК, другие методы. Так, за ходом денатурации

белка можно следить методами флуоресценции или КД. Если про

цесс денатурации при постоянной температуре описывается кине

тическим уравнением первого порядка, то из получаемых для

каждой температуры значений константы скорости k на основании

уравнения Аррениуса (уравнение (3) или (4)) можно вычислить

значения энергии активации E

a

 и параметра A или T



*

.

Определенные таким образом значения энергии активации



отличались от значений энергии активации, определенной из

анализа кривых ДСК, на 20% для G–актина [48] и бромелаина [14].

Для целлюлазы [31], лектина из чечевицы [87], и липазы B [88]


Необратимая тепловая денатурация белков

59

значения  E



a

, определенные методами ДСК и изотермической

денатурации, совпадали в пределах экспериментальной ошибки.

Аналогичным образом значения параметров уравнения Арре

ниуса могут быть получены из данных по изотермической инакти

вации. Строго говоря, инактивация фермента и его денатурация

(разворачивание) являются разными процессами. Согласно данным

Цоу [10, 110], инактивация предшествует разворачиванию белковой

глобулы, поэтому результаты, полученные методами инактивации

и ДСК, не обязательно должны совпадать. Тем не менее в ряде работ

было показано совпадение (в пределах экспериментальной ошибки)

значений E

a

, полученных этими методами. Так, для ацетилхолин



эстеразы [45], целлюлазы [31], АТФ–синтазы [102] и комплекса F

1

АТФазы хлоропластов [105] значения энергии активации, опреде



ленные из анализа кинетики инактивации, отличались от значений

энергии активации, определенных из анализа кривых ДСК, не более

чем на 8%.

Ряд физических методов позволяет получать интегральные

кривые денатурации, т.е. зависимости доли денатурированного

белка от температуры. Например, изменяя температуру с постоян

ной скоростью, можно непрерывно следить за изменением конфор

мационного состояния белка методами флуоресценции или КД.

Для анализа подобных кривых Фуджита и соавт. [27] предложили

методы оценки параметров уравнения Аррениуса с помощью

приближенных уравнений:

и

где T



1/2

 – температура, при которой денатурирует половина молекул

белка (определяется из интегральной кривой). Уравнение (21)

позволяет из линейной зависимости T

1/2

 от ln


ν

  найти отношение



R(T

*

)



2

/E

a

, а затем параметры E



a

 и T

*

. Уравнение (22) позволяет найти



отношение R(T

*

)



2

/E

a

 из линейной зависимости ln(–ln



γ

N

/ln2) от



(T – T

1/2


), а затем параметры уравнения Аррениуса из уравнения

(21). Данные способы не нашли широкого применения. Фуджита с

соавт. [27] получили для термолизина при pH 8,2 значение энергии

активации 340 кДж/моль, которое на 3% отличается от значения,

полученного впоследствии методом ДСК при тех же условиях [84].


А.Е.Любарев, Б.И.Курганов

60

Руиз–Санз с соавт. [81] анализировали интегральные кривые,



полученные для трех фракций миелиновых белков методом термо

гелевого анализа (thermal gel analysis) с помощью уравнения,

аналогичного уравнению (16) для дифференциальных кривых:

γ

Ν



 = exp{–exp[E

a

(T – T



m

)/(RT

m

2

)]}.



(23)

Морин с соавт. [68] предложили анализировать интегральные

кривые с помощью уравнения (6), используя нелинейный метод

наименьших квадратов. Данным способом из экспериментальных

данных по термогелевому анализу цитохромоксидазы, реконст

руированной в липосомы, были получены значения параметров

уравнения Аррениуса для разных субъединиц фермента [68].

Способ, основанный на уравнении (6), использовался также для

анализа данных по инактивации липазы B [88] и по денатурации

лектина из чечевицы на основе данных инфракрасной спектро

скопии [59]. Расхождения с результатами, полученными методом

ДСК, не превышали 10%.

В работе [14] с использованием КД–спектроскопии были полу

чены интегральные кривые для бромелаина при разных скоростях

нагрева. Эти кривые анализировались с помощью уравнений (10) и

(15). В последнем случае вместо отношения 



H/(



H – Q) исполь

зовалось эквивалентное выражение 1/

γ

N



. Значения энергии акти

вации, полученные с использованием уравнений (10) и (15),

отличались друг от друга на 22%, а от значения параметра, полу

ченного методом ДСК, соответственно, на 27 и 7%.

КРИТЕРИИ СООТВЕТСТВИЯ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ДАННЫХ

ОДНОСТАДИЙНОЙ МОДЕЛИ

В работе [84] в качестве главного критерия соответствия экспе

риментальных данных обсуждаемой модели использовалось совпа

дение значений энергии активации, полученных с помощью разных

способов расчета. При этом отмечалось, что способы, предло

женные в данной работе, используют разные приближения и разную

экспериментальную информацию. Этот критерий использовался и

в ряде последующих работ [22, 31, 36, 45, 87, 109]. Анализ табл. 2

показывает, что в ряде случаев разброс значений оказывается

существенным. Так, для ацетилхолинэстеразы разница между

наибольшим и наименьшим значениями энергии активации,

определенными разными способами, составила 15%, а для аннек

сина – 27%.

Более важный критерий – совпадение значений параметров

уравнения Аррениуса, рассчитанных для разных скоростей. К сожа



Необратимая тепловая денатурация белков

61

лению, в большинстве работ приводятся лишь средние значения



параметров, а не значения для конкретных скоростей. Определенное

представление о разбросе значений энергии активации, рассчитан

ных для разных скоростей сканирования, можно получить из

значений стандартных ошибок, обычно приводимых вместе со сред

ними значениями параметра. Как видно из табл. 2, в ряде случаев

стандартные ошибки составляют более 10% от среднего значения.

Однако из значений стандартных ошибок нельзя определить,

имеют ли данные ошибки случайный характер или существует за

висимость кажущихся значений параметра от скорости скани

рования. В работе [46] было показано, что значение энергии

активации для целлюлазы, рассчитанное для скорости сканиро

вания 0,21 град/мин, ниже на 11% значений этого параметра,

рассчитаных для скоростей сканирования 0,50, 0,99 и 1,45 град/мин

(последние различались между собой менее чем на 0,5% при расчете

способом, основанным на уравнении (9)). В этой же работе было

показано, что значения энергии активации для ацетилхолин

эстеразы, рассчитанные для скоростей сканирования 0,22 и 0,34

град/мин, выше на 8–12% значений этого параметра, рассчитаных

для скоростей сканирования 0,76, 0,99 и 1,45 град/мин.

Был предложен также ряд критериев, основанных на построении

графических анаморфоз кривых ДСК. В частности, в соответствии

с уравнениями (10), (15) и (17), графики в координатах {ln(

ν

/T



m

2

);



1 /T

m

}, {ln (ln [





/(



– Q)]); 1 /} и {ln [

ν

C

p

ex



/ (



– Q)]; 1/}

должны быть линейны.

В работе [13] для 

β

–лактамазы было показано, что график в



координатах {ln (ln [



H/(



– Q)]); 1/} близок к линейному, в то

время как график в координатах {ln (

ν

/T



m

2

); 1 / T



m

} сильно искрив

лен. В работе [23] для ксиланазы, напротив, оказалось, что график

в координатах {ln (

ν

/T



m

2

); 1/T



m

} вполне удовлетворяет односта

дийной модели, а графики в координатах {ln (ln [



H/(



– Q)]);

1/} и {ln[

ν

C

p

ex



/(



– Q)]; 1/} существенно искривлены.

Уравнение (14) позволяет определить значения константы ско

рости k для любой температуры (в исследуемом интервале) из кри

вой ДСК. Рассчитанные таким образом значения k должны совпа

дать для разных скоростей сканирования [22, 28]. Этим критерием

удобно пользоваться, если построить график {ln[

ν

C

p

ex

/(





– Q)];

1/}. В случае выполнимости одностадийной модели, точки,

полученные при разных скоростях сканирования, на этом графике

должны лежать на одной линии [22, 46].

Следует отметить, что уравнение (14) было выведено без исполь

зования предположения о выполнимости уравнения Аррениуса [84].



А.Е.Любарев, Б.И.Курганов

62

Таким образом, данный критерий должен выполняться даже в том



случае, когда не выполняется уравнение Аррениуса и зависимость

{ln [


ν

C

p

ex



/(



– Q)]; 1/} имеет нелинейный характер.

Примером выполнимости данного критерия может служить

тепловая денатурация креатинкиназы (рис. 2) [55]. Отметим, что

для эффективности применения данного критерия необходимо

использовать большое число точек для каждой скорости сканиро

вания. К сожалению, во многих работах использовалось небольшое

(5–7) число точек, что снижало надежность сделанных выводов. Так,

в работе [31], посвященной тепловой денатурации целлюлазы,

для построения линейной анаморфозы {ln [

ν

C

p

ex



/(



– Q)]; 1/}

использовалось по 6 точек для каждой скорости сканирования. На

приведенном в этой работе

графике использованные точ

ки выглядят лежащими на од

ной прямой. Однако, при ис

пользовании большего числа

точек видно, что точки лежат

на разных линиях (рис. 3) [46].

В работе [46] было пред

ложено еще два критерия вы

полнимости одностадийной

модели. Было показано, что

выражение (1 – /



H)

ν

 в слу


чае выполнимости данной мо

дели не зависит от скорости

сканирования. Поэтому в ко

ординатах {(1 – /



H)

ν

;  }



линии, соответствующие раз

ным скоростям сканирования,

должны совпадать. На рис. 4

показан пример такого гра

фика для целлюлазы [46], из

которого видно, что линии в

данном случае не совпадают.

Другой критерий связан с

построением графических ана

морфоз {lnC

p

ex

; 1 /}. Пока



зано, что в данных координа

тах в случае выполнимости од

ностадийной модели кривые,

построенные для разных ско

Рис. 2. Зависимости  1/T от ln[

ν

C

p

ex

/





– Q)] для креатинкиназы из ске

летных мышц кролика [55].

Рис. 3. Зависимости  1/T от ln[

ν

C

p

ex

/





– Q)] для целлюлазы из Streptomyces

halstedii JM8 [46].

Необратимая тепловая денатурация белков

63

ростей сканирования, имеют



одинаковую форму, но сдви

нуты друг относительно друга

по обеим координатам. Если

совместить эти кривые в положе

нии максимума, кривые дол

жны совпасть. На рис. 5 пока

зан пример такого графика для

целлюлазы [46], из которого

видно, что кривые в данном

случае не совпадают.

Анализ, проведенный в ра

боте [46], показал, что графи

ческая анаморфоза в коорди

натах {lnC

p

ex

; 1 /} наилучшим образом показывает различия в



кажущихся значениях энергии активации, рассчитанных для разных

скоростей сканирования. Напротив, графические анаморфозы в

координатах {ln[

ν

C

p

ex

/(





– Q)]; 1/} и {(1 – /



H)

ν

;  } лучше



демонстрируют различия в кажущихся значениях параметра T

*

. Как



можно видеть из рис. 3–5, в одном случае линия, построенная для

наименьшей скорости сканирования, сильно отделена от трех

других; в двух других случаях сильно расходятся две пары линий.

IV. ОТКЛОНЕНИЯ ОТ ОДНОСТАДИЙНОЙ МОДЕЛИ

НЕСООТВЕТСТВИЕ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ДАННЫХ

КРИТЕРИЯМ ВЫПОЛНИМОСТИ ОДНОСТАДИЙНОЙ МОДЕЛИ

В работе [22] было отмечено, что тепловая денатурация карбокси

пептидазы B при pH 9,0 (в отличие от процесса при pH 7,5) плохо

описывается одностадийной моделью: сильно различаются значе

ния энергии активации, рассчитанные разными методами, и

аппроксимация экспериментальных данных уравнением (16)

является неудовлетворительной. Аналогичный вывод был сделан

для тепловой денатурации бактериородопсина [28].

      В работе [29], посвященной тепловой денатурации фосфо

глицераткиназы, отмечалось, что одностадийная модель не позво

ляет  адекватно описать данные ДСК, поскольку 

«константы ско

рости

», рассчитанные для разных скоростей сканирования, не сог



ласуются друг с другом. Аналогичная ситуация наблюдалась для глю

козамин–6–фосфатдезаминазы [39] и 

β

–лактамазы I [13]. Авторы



работы [13], кроме того, отметили, что зависимость ln (

ν

/T



m

2

)



Рис. 4. Зависимости (1 – /



H)

ν

 от


температуры для целлюлазы из Strep

tomyces halstedii JM8 [46].

А.Е.Любарев, Б.И.Курганов

64

от 1 /T



m

 имеет нелинейный характер.

Отклонение данной зависимости от

линейности отмечалось также для кис

лой протеиназы [100].

       В работе [103] отмечались большие

значения ошибок в оценке энергии

активации для аннексина V (см. табл.

2). Кроме того, приведенные в дан

ной  работе графики в координатах

{ln (ln [



H/(



– Q)]); 1/} и {ln[

ν

C

p

ex

/



(



– Q)]; 1 /} существенно искрив

лены, а зависимости ln[

ν

C

p

ex

/(





– Q)]

от 1/ для разных скоростей скани

рования не лежат на одной линии.

Сходная картина наблюдалась в работе

[23] для ксиланазы.

     В работе [46] показано, что тепло

вая денатурация ацетилхолинэсте

разы, целлюлазы и чечевичного лек

тина не удовлетворяет предложенным в этой работе критериям (см.

предыдущий раздел и рис. 3–5).

ПОЯВЛЕНИЕ ДОПОЛНИТЕЛЬНОГО ЭКЗОТЕРМИЧЕСКОГО ПИКА

В ряде работ отмечалось наличие на кривой ДСК небольшого

отрицательного (экзотермического) пика сразу после прохождения

основного пика. Такие данные получены для гликогенфосфорилазы



b из скелетных мышц кролика [17], малатдегидрогеназы из Escheri

chia coli [33], азурина [47, 64] и пластоцианина [65].

В некоторых работах отмечалось, что появление экзотермичес

кого пика обусловлено недостатками прибора и не наблюдается при

переходе к более совершенной технике [24, 58, 63]. Тем не менее,

предполагается, что экзотермический пик может свидетельствовать

о протекании экзотермических процессов, сопровождающих дена

турацию, в частности, процесса агрегации [17, 33, 47].

Для азурина [47] и пластоцианина [65] показано, что амплитуда

экзотермического пика снижается при увеличении скорости скани

рования. Авторы объясняют этот эффект в рамках модели Ламри–

Эйринга (см. раздел V).

ЗАВИСИМОСТЬ ФОРМЫ КРИВЫХ ОТ КОНЦЕНТРАЦИИ БЕЛКА

Поскольку одностадийная модель описывается кинетическим

уравнением первого порядка (5), в рамках данной модели молярные

Рис. 5. Зависимости lnC

p

ex



  от

обратной температуры для цел

люлазы из Streptomyces halstedii

JM8 [46].



Необратимая тепловая денатурация белков

65

значения избыточной теплоемкости не должны зависеть от кон



центрации белка. Однако, в ряде работ отмечалось влияние концен

трации белка на форму кривой ДСК и на положение максимума.

Так, в работе [29] было показано, что увеличение концентрации

фосфоглицераткиназы с 0,2 до 2 мг/мл сдвигает положение

максимума примерно на 1,5 градуса в сторону более низких темпе

ратур. Напротив, увеличение концентрации гликогенфосфорилазы



b от 0,5 до 6 мг/мл [1], глюкозамин–6–фосфатдезаминазы с 0,6 до

7,3 мг/мл [39] и супероксиддисмутазы от 2,6 до 8,0 мг/мл [34]

приводило к сдвигу положения максимума в область более высоких

температур, соответственно, на 1, 2,5 и 3 градуса.

В случае термолизина увеличение концентрации белка не влияло

существенно на положение максимума, но снижало энтальпию

денатурации [20].

Наличие концентрационного эффекта означает существенный

вклад бимолекулярных реакций в кинетику денатурации. В случае

олигомерных белков (таких как глюкозамин–6–фосфатдезаминаза,

супероксиддисмутаза и гликогенфосфорилаза) концентрационный

эффект может объясняться вкладом обратимой диссоциации

олигомера, которая предшествует стадии денатурации [82]. Для

мономерной фосфоглицераткиназы предполагается вклад бимо

лекулярных процессов агрегации [29], а для термолизина – вклад

автолиза [20].

ВЛИЯНИЕ СКОРОСТИ СКАНИРОВАНИЯ

НА ЭНТАЛЬПИЮ ДЕНАТУРАЦИИ

Во многих работах значения калориметрической энтальпии,

рассчитанные для разных скоростей сканирования, существенно

различались. С увеличением скорости сканирования от 0,2

)0,3 до


1 град/мин значения 



H для лектина из чечевицы (при pH 7,4) [59],

супероксиддисмутазы [34] и уридинфосфорилазы [54] повышались

примерно на 30%, для азурина – на 85% [47], а для пластоцианина –

на 100% [65]. Для 

δ

–эндотоксина значение 





H повышалось на 40%

с увеличением скорости сканирования с 0,125 до 2 град/мин [72], а

для глутатионредуктазы – на 60% с увеличением скорости скани

рования с 0,5 до 1,5 град/мин [79]. Противоположная тенденция

наблюдалась для целлюлазы [31]

1

 и липазы B [88]: с увеличением



скорости сканирования от 0,2 до 1,5 град/мин энтальпия снижалась

на 20


)25%. Для лизоцима в присутствии хлорбутанола энтальпия

снижалась на 40% с увеличением скорости сканирования от 0,3 до 1

1

 Рассчитано нами на основании данных, представленных авторами статьи.



А.Е.Любарев, Б.И.Курганов

66

град/мин [43]. В случае тепловой денатурации ацетилхолинэс



теразы  максимальное значение энтальпии наблюдалось для про

межуточной скорости сканирования 0,76 град/мин; для скоростей

сканирования 0,22 и 1,45 град/мин оно было ниже на 10

)15%


1

. Для


карбоксипептидазы B и прокарбоксипептидазы B в зависимости от

pH и молярности буфера соотношение значений энтальпии, полу

ченных для разных скоростей сканирования (от 0,25 до 2 град/мин),

было разным; тем не менее наименьшие значения энтальпии всегда

соответствовали наименьшей скорости сканирования, а наиболь

шие значения – в большинстве случаев наибольшим скоростям

сканирования; при pH 9,0 в 20 мМ пирофосфатном буфере разница

составляла около 40% [22].

Заметим, что во многих работах не приводятся данные об

энтальпии денатурации при разных скоростях сканирования.

Следует отметить две работы, в которых энтальпия практически не

зависела от скорости сканирования: для аннексина различия в

энтальпии не превышали 4% при изменении скорости скани

рования от 0,125 до 2,342 град/мин [103]; для креатинкиназы при

увеличении скорости сканирования с 0,125 до 1 град/мин энтальпия

снижалась всего на 5% [55].

В работах [54, 79] было высказано ошибочное мнение, что

энтальпия денатурации не должна зависеть от скорости сканиро

вания, если процесс денатурации приводит к одному и тому же

конечному состоянию. Этот вывод был сделан, исходя из того

соображения, что энтальпия – функция состояния, поэтому изме

нение энтальпии не зависит от особенностей перехода между

начальным и конечным состояниями, если сами начальное и

конечное состояния идентичны.

Однако такие рассуждения не учитывают, что изменение энталь

пии в ходе денатурации складывается из двух составляющих.

Изменение энтальпии, связанное с процессом денатурации (т.н.

избыточная энтальпия) – одна из этих составляющих. Другая

составляющая – изменение энтальпии, связанное с увеличением

температуры системы. Суммарное изменение энтальпии действи

тельно не должно зависеть от особенностей перехода между началь

ным и конечным состояниями, но при этом величины каждой

составляющей могут изменяться в зависимости от условий перехода

(в том числе скорости сканирования).

Такая ситуация возможна, если теплоемкости нативной и

денатурированной форм белка не одинаковы. Согласно закону

1

 Рассчитано нами на основании данных, представленных авторами статьи.



Необратимая тепловая денатурация белков

67

Кирхгофа, в этом случае энтальпия процесса зависит от температуры.



Обычно теплоемкость денатурированной формы белка больше

теплоемкости нативной формы, поэтому с повышением температуры

энтальпия денатурации должна увеличиваться. Поскольку при

повышении скорости сканирования температурный интервал, при

котором происходит денатурация, сдвигается в область более высоких

температур, избыточная энтальпия должна увеличиваться.

Таким образом, зависимость избыточной энтальпии от скорос

ти сканирования в принципе не противоречит одностадийному

механизму денатурации. Однако, поскольку уравнения (7)–(9) и

(13)–(18) были получены исходя из предположения о том, что

энтальпия денатурации является константой, эти уравнения в

данном случае должны быть скорректированы.

В работе [54] обсуждаются три другие возможные причины

зависимости калориметрической энтальпии от скорости скани

рования. Одна из них – различия в концентрации белка в экспери

ментах с разными скоростями сканирования, обусловленные

недостаточной точностью при приготовлении белковых растворов.

Однако, этой причиной трудно объяснить расхождения, достигаю

щие 30%, а также наличие определенных тенденций зависимости

энтальпии от скорости сканирования.

Другая возможная причина – различие конечных состояний

белка при разных скоростях сканирования. Такое различие может

быть связано с образованием белковых агрегатов, форма которых

зависит от скорости денатурации, а следовательно, и от скорости

сканирования. Можно предположить, что при более медленной

денатурации вклад агрегации больше, а так как агрегация обычно

сопровождается выделением тепла, суммарный тепловой эффект

процесса оказывается ниже.

Третья возможная причина – неточность при вычитании «хими

ческой базовой линии», которая связана с различием в теплоемкости

нативной и денатурированной форм белка. Эта процедура обычно

проводится по методу Такахаши–Стюртеванта [98]. Данный метод

считается вполне корректным для одностадийной модели, то есть

для случая, когда в процессе денатурации не появляется заметного

количества белка, находящегося в промежуточном состоянии. Если

это условие не выполняется, необходимо учитывать также тепло

емкость промежуточного состояния, значение которой невозможно

измерить.



А.Е.Любарев, Б.И.Курганов

68

V. МОДЕЛЬ ЛАМРИ–ЭЙРИНГА И ДРУГИЕ ДВУХСТАДИЙНЫЕ



МОДЕЛИ

МОДЕЛЬ ЛАМРИ–ЭЙРИНГА И ЕЕ ЧАСТНЫЕ СЛУЧАИ

В работе, посвященной анализу модели одностадийной необра

тимой денатурации, Санчез–Руиз и соавт. [84] отмечали, что модель

Ламри–Эйринга (1) является более реалистичной моделью денату

рации белка, и модель (2) следует рассматривать как частный случай

модели Ламри–Эйринга. Позже Санчез–Руиз [82] рассмотрел две

ситуации, когда модель Ламри–Эйринга может быть сведена к

одностадийной необратимой модели (см. раздел II).

Лепок и соавт. [50] провели теоретический анализ полной

кинетической модели Ламри–Эйринга для случая, когда тепловой

эффект второй стадии равен нулю. Варьировались соотношения

значений k

1

 и k



2

 для температуры, при которой k

1

k



—1

, и скорости

сканирования. Были определены соотношения, при которых модель

Ламри–Эйринга может быть сведена к одностадийной обратимой

или одностадийной необратимой моделям.

В работе [3] анализировался наиболее общий случай полной

кинетической модели Ламри–Эйринга, когда обе стадии сопровож

даются заметным тепловым эффектом. Исследовалось изменение

формы кривых при варьировании значений различных параметров

модели и скорости сканирования.

Следует отметить, что система дифференциальных уравнений,

описывающая полную кинетическую модель Ламри–Эйринга, при

переменной температуре не имеет аналитического решения. Это

затрудняет использование данной модели. До сих пор нет ни одной

работы, в которой данные ДСК удалось бы количественно описать

в рамках полной кинетической модели Ламри–Эйринга.

Более простыми двухстадийными моделями являются два

частных случая полной кинетической модели Ламри–Эйринга:

модель Ламри–Эйринга с быстро устанавливающимся равновесием

на первой стадии и модель, включающая две последовательно

протекающие необратимые стадии.

МОДЕЛЬ ЛАМРИ–ЭЙРИНГА С БЫСТРО УСТАНАВЛИВАЮЩИМСЯ

РАВНОВЕСИЕМ НА ПЕРВОЙ СТАДИИ

Модель (24)

является частным случаем модели (1), когда значения констант

скорости  k

1

 и k



—1

 значительно превышают значение константы k

2

,


Необратимая тепловая денатурация белков

69

и, таким образом, в каждый момент времени равновесие на первой



стадии можно считать установившимся. В работе Санчез–Руиза [82]

было получено аналитическое выражение зависимости избыточной

теплоемкости от температуры для данной модели для случая, когда

тепловой эффект второй стадии равен нулю. Миларди и соавт. [64]

получили аналитическое выражение зависимости C

p

ex



 от  для более

общего случая:

где 



H



u

 – изменение энтальпии на первой стадии, 



H

i

 – изменение

энтальпии на второй стадии, – константа равновесия для первой

стадии (= exp[—



H

u

(1/— 1/T



1/2

)/R]),  k

2

 – константа скорости



второй стадии (= exp[—E

a

(1/— 1/T



*

)/R]);  T

1/2

 – температура,



при которой = 1, T

*

 – температура, при которой = 1 мин



–1

.

Санчез–Руиз [82] провел теоретический анализ модели (24) для



случая, когда тепловой эффект второй стадии равен нулю. Миларди

и соавт. [64] анализировали ситуацию, когда вторая стадия является

экзотермической. В этом случае возможно появление отрица

тельного пика. Для выбранного авторами набора параметров

отрицательный пик появлялся при скоростях сканирования 0,5

град/мин и выше.

В ряде работ предпринимались попытки использовать модель

(24) для количественного описания данных ДСК. Так, в работе [103]

использовалась формула, полученная Санчез–Руизом [82] при

условии, что 



H

i

= 0. Значение E



a

 (общее для четырех кривых,

полученных при разных скоростях сканирования) было рассчитано

на основании уравнений (3) и (14), значение 



H

u   


 для каждой

скорости сканирования – как площадь под кривой ДСК. Оптималь

ные значения параметров T

1/2


 и T

*

 были подобраны, при этом



значения  T

1/2


 для скоростей 0,125 и 2,342 град/мин различались

на 2,8 градуса, а значения T

*

 – на 2,1 градуса. Такие различия не



дают оснований считать описание адекватным.

В работе [47] данные ДСК для азурина, полученные при скоростях

сканирования 0,3, 0,5, 0,7 и 1 град/мин, аппроксимировались

уравнением (25). Каждая кривая обрабатывалась отдельно. Для

скоростей сканирования 0,5 и 0,7 град/мин получены близкие

результаты, в то же время оптимальные значения параметров,



А.Е.Любарев, Б.И.Курганов

70

полученные для скоростей 0,7 и 1 град/мин, различались: 





H

i

 – на

12%, E

a

 – в 2,7 раза, T



*

 – на 5,8 градуса. Столь же большие различия

наблюдались и в случае данных ДСК для азурина в D

2

O [37]. Из



этих результатов невозможно сделать вывод, что тепловая денату

рация азурина подчиняется модели (24). Аналогичные результаты

были получены той же группой авторов для пластоцианина –

оптимальные значения параметров, полученные для скоростей 0,3

и 0,7 град/мин, различались: 



H

i

 – в 2,8 раза, E

a

 – на 15%, T



*

 – на


5,9 градуса [65].

МОДЕЛЬ, ВКЛЮЧАЮЩАЯ НЕСКОЛЬКО ОБРАТИМЫХ

И ОДНУ НЕОБРАТИМУЮ СТАДИИ

В работе [26] анализируется более общая модель, включающая

несколько последовательно протекающих обратимых стадий и на

конце одну необратимую:

Как и для модели (24), здесь предполагается, что в каждый момент

времени равновесие на всех обратимых стадиях можно считать

установившимся. Для данной модели авторы [26] получили следую

щее уравнение:

где  Q – текущее количество теплоты, поглощаемое в процессе

денатурации,  Q

e

 – текущее количество теплоты, поглощаемое на



обратимых стадиях, k

app


 – кажущаяся константа скорости первого

порядка.


Имея несколько кривых ДСК, полученных при разных скорос

тях сканирования, можно для каждой температуры построить

зависимость  Q от 1/

ν

. Поскольку Q



e

 и k

app

 не зависят от скорости



сканирования, данная зависимость имеет экспоненциальный

характер. Экстраполяция полученной кривой к бесконечно большой

скорости сканирования (1/

ν

= 0) дает значение Q



e

. Таким образом

можно построить зависимость значений Q

e

 от температуры и



получить значение изменения энтальпии на обратимых стадиях.

Этот метод использовался при анализе тепловой денатурации

супероксиддисмутазы [34], азурина [47] и пластоцианина [65]. В ра

боте [39], посвященной тепловой денатурации глюкозамин–6–фос

фатдезаминазы, для экстраполяции использовалась зависимость

ln (1 – /



) от 1/

ν

.



Необратимая тепловая денатурация белков

71

МОДЕЛЬ, ВКЛЮЧАЮЩАЯ РАВНОВЕСНУЮ ДИССОЦИАЦИЮ



В работе Санчез–Руиза [82] теоретически исследуется вариант

модели Ламри–Эйринга, когда первая стадия представляет обрати

мую диссоциацию олигомерного белка на субъединицы:

где 


µ

 – число субъединиц в олигомере. Рассмотрен лишь случай,

когда равновесие на первой стадии устанавливается быстро, а

= [U]

µ

/ [N



µ

] << 1. Для этого случая получено выражение для

зависимости избыточной теплоемкости от температуры, анало

гичное выражению (16) для одностадийной модели:

где  E

a, app


 – кажущаяся энергия активации, равная E

a

+





/

µ

.



Получено также уравнение, связывающее температуру, соответ

ствующую максимальному значению избыточной теплоемкости

(T

m

), с общей концентрацией белка (C



t

) :


E

a,app


/(RT

m

) – 2 lnT



m

+ (


µ

– 1)/


µ

  lnС

t

= const .



(30)

Поскольку величина члена 2 lnT

m

  меняется с изменением зна



чения T

m

 в значительно меньшей степени, чем величина члена



E

a, app


/(RT

m

), зависимость ln С



t

 от 1/T

m

 в рамках данной модели



должна представлять собой прямую линию.

МОДЕЛЬ, ВКЛЮЧАЮЩАЯ ДВЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНО

ПРОТЕКАЮЩИЕ НЕОБРАТИМЫЕ СТАДИИ

Еще одним частным случаем полной кинетической модели

Ламри–Эйринга является модель, включающая две последова

тельно протекающие необратимые стадии:

Эта модель реализуется для ситуации, когда скорость обратной

реакции на первой стадии мала по сравнению со скоростью второй

стадии (k

—1

<< k

2

). В отличие от одностадийной необратимой мо



дели в данном случае скорость прямой реакции первой стадии

сравнима по величине со скоростью второй стадии.



А.Е.Любарев, Б.И.Курганов

72

Нами проведен теоретический анализ модели (31) [2]. Получено



аналитическое выражение зависимости C

p

ex



 от T  [2, 54]:

(индексы 1 и 2 относятся, соответственно, к первой и второй ста

диям).

С учетом предположения, что константы скорости k



1

 и k

2

подчиняются уравнению Аррениуса (4), зависимость избыточной



теплоемкости от температуры определяется скоростью скани

рования 


ν

 и шестью параметрами процесса денатурации: энталь

пией, энергией активации и параметром T

*

 для каждой стадии.



Как видно из уравнения (32), значение избыточной тепло

емкости является суммой двух слагаемых, соответствующих двум

стадиям процесса. Поэтому профиль C

p

ex



 от T можно разложить на

две составляющие. Первое слагаемое в уравнении (32) аналогично

выражению для избыточной теплоемкости (9), полученному для

одностадийной модели. Его величина определяется скоростью

сканирования и тремя параметрами первой стадии. Второе слагае

мое в уравнении (32), соответствующее второй стадии процесса,

зависит от параметров не только этой, но и первой стадии (кроме



H

1

). Это понятно, так как скорость второй стадии определяется не



только константой скорости для этой стадии, но и концентрацией

формы U, образующейся на первой стадии.

В зависимости от соотношений значений параметров модели

кривые ДСК, удовлетворяющие данной модели, могут представлять

один пик (с разной степенью асимметрии) или состоять из двух пи

ков. Если вторая стадия экзотермическая (



H

2

< 0), второй пик будет

отрицательным, так же как для модели Ламри–Эйринга с быстро

устанавливающимся равновесием на первой стадии.

Скорость сканирования может существенно влиять на форму

кривой ДСК. Так, при E

a, 1

E



a, 2

 чем больше скорость сканирования,

тем быстрее процесс переходит в область, где k

1

 становится больше,



чем k

2

, и где происходит накопление интермедиата U. В результате



при больших скоростях сканирования на кривых ДСК может

появиться второй пик (или плечо), отсутствующий на кривых,

соответствующих малым скоростям сканирования (рис. 6а). Напро


Необратимая тепловая денатурация белков

73

тив, при E



a, 1

E

a, 2


, когда на

коплению интермедиата спо

собствуют более низкие тем

пературы, разделение пиков

происходит более эффектив

но при меньших скоростях

сканирования (рис. 6б).

Появление отрицатель

ного пика в случае экзотер

мической второй стадии так

же может зависеть от ско

рости сканирования. На

рис. 7 показан случай, ког

да при малой скорости (0,25

град/мин) отрицательный

пик практически незаметен,

а с повышением скорости

сканирования он становится

все более существенным.

С помощью модели (31)

нами была описана тепловая

денатурация уридинфос

форилазы из Escherichia coli

K–12 [4, 54]. Кривые ДСК

были получены при скорос

тях сканирования 0,25, 0,5 и

1 град/мин. Проверялось со

ответствие данных кривых

трем моделям: одностадий

ной модели необратимой де

натурации (2), модели Лам

ри–Эйринга с быстро уста

Рис. 6. Влияние скорости сканирования

на форму температурных профилей избы

точной теплоемкости для модели (31) [2].

      Для всех кривых E

a, 1

= 500 кДж/моль,





H

1





H

= 200 кДж/моль, T



*

1

 = 328,16 K



(55 °С). Значения E

a, 2


 

 : 350 (а), 1000 кДж/

моль (б), значения T

*

2



  :  332,16 К (а), 330,16

К (б). Значения v  указаны над кривыми.

Рис. 7. Влияние скорости ска

нирования на величину отрица

тельного пика при экзотерми

ческой второй стадии для модели

(31) [2].

Для всех кривых E

a, 1

 E

a, 1


= 500

кДж/моль, 



H

1

 = 600 кДж/моль,





H

2

 = –200 кДж/моль, T



*

1

T



*

2

=



= 328,16 K (55 °C). Значения v

указаны над кривыми.



А.Е.Любарев, Б.И.Курганов

74

навливающимся равновесием на первой стадии (24) и модели (31),



включающей две последовательно протекающие необратимые ста

дии. Аппроксимация проводилась одновременно по всем кривым,

так как для двухстадийных моделей (24) и (31), содержащих, соот

ветственно, пять и шесть параметров, точность оценки параметров

с использованием одной кривой получается довольно низкой.

         Оказалось, что модель (31) описывает тепловую денатурацию

уридинфосфорилазы с большей точностью, чем две другие модели.

Если для моделей (2) и (24)

коэффициент корреляции,

отражающий соответствие

между теоретическими и

экспериментальными кри

выми составлял 0,994, а от

клонения отдельных экспе

риментальных точек от тео

ретических кривых дохо

дили до 10% от максималь

ного значения избыточной

теплоемкости, то для моде

ли (31) коэффициент кор

реляции составил 0,999, а

максимальное отклонение

экспериментальных точек

от теоретических кривых не

превышало 5% от макси

мального значения избы

точной теплоемкости. На

рис. 8 видно, что теорети

ческие кривые хорошо сов

падают с эксперименталь

ными. Таким образом, был

сделан вывод, что тепловая

денатурация уридинфос

форилазы из Escherichia coli

K–12 удовлетворительно

описывается моделью, вклю

чающей две последователь

но протекающие необрати

мые стадии [4, 54].

Рис. 8. Результаты аппроксимации урав

нением (32) экспериментальных темпе

ратурных профилей избыточной тепло

емкости, полученных для уридинфосфо

рилазы из Escherichia coli при скоростях

сканирования температуры: 0,25 град/мин

(прямоугольники), 0,5 град/мин (кружки)

и 1 град/мин (треугольники); а – экспе

риментальные данные и теоретические

кривые (сплошные линии), б – остаточ

ные разности (

δ

) [4, 54].



Необратимая тепловая денатурация белков

75

VI. БОЛЕЕ СЛОЖНЫЕ МОДЕЛИ

В работах группы Лепока денатурация Ca

2+

–АТФазы [12, 51] и



супероксиддисмутазы [49] была описана с помощью модели,

включающей две независимо протекающие необратимые реакции.

В работе Николовой и соавт. [69] была получена сигмоидальная

зависимость логарифма константы скорости инактивации экзо

глюканазы/ксиланазы (Cex) от обратной температуры. На основа

нии этой зависимости была предложена модель денатурации,

включающая одну обратимую и две необратимые стадии, которые

приводят к двум различным продуктам:

С помощью данной модели описывались данные по кинетие инак

тивации фермента. О попытках описать данные ДСК с помощью

модели (33) ничего не известно.

В работе [79] высказано предположение, что тепловая денату

рация тетрамерной глутатионредуктазы подчиняется механизму,

включающему обратимую диссоциацию на димеры, обратимое

разворачивание димеров и последующее образование двух разных

агрегированных форм белка:

Никаких попыток описать экспериментальные данные с помощью

этой модели не было.

В работе Корнилаева и соавт. [1] на основании данных ДСК,

изотермической денатурации и седиментации для гликогенфос

форилазы  b предложена модель денатурации фермента, вклю

чающая обратимую предденатурационную стадию, обратимую

диссоциацию димерного белка на мономеры и параллельно проте

кающие необратимые стадии денатурации димера и мономеров:

Эта модель также не была реализована в виде математического

описания.



А.Е.Любарев, Б.И.Курганов

76

В работе Галистео и соавт. [29] на основании данных по зависи



мости скорости инактивации фосфоглицераткиназы и положения

максимума на кривых ДСК от концентрации фермента было

предложено эмпирическое уравнение, описывающее кинетику

денатурации:

где  C

N

 – концентрация нативной формы белка, 



α

() и 

β

() –



параметры, зависящие от температуры. Зависимость ln

α

 от тем



пературы оказалась линейной, а ln

β

 – параболической.



VII. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ПОВТОРНОГО СКАНИРОВАНИЯ

ДЛЯ АНАЛИЗА КАЛОРИМЕТРИЧЕСКИХ КРИВЫХ

СЛОЖНОЙ ФОРМЫ

В разделе II обсуждалось использование повторного прогрева для

выяснения вопроса об обратимости процесса денатурации. Для этой

цели повторный прогрев проводится после завершения процесса.

Однако, если остановить прогрев в момент, когда денатурация еще

не закончена, охладить образец и провести повторное сканирова

ние, можно получить новую информацию о механизме денатурации.

Так, в случае выполнимости одностадийной модели, при повтор

ном прогреве должен воспроизводиться тот же пик, что и при

первом сканировании, но уменьшенный по амплитуде в соответ

ствии с долей белка, оставшегося нативным после первого прогрева

и охлаждения. На рис. 9 показан результат повторного сканирования

для липазы B [88]. Видно, что первоначальная кривая может быть

получена из повторного скана, если все точки последнего умножить

на отношение калориметрических энтальпий этих двух сканов.

Аналогичные результаты получены для 

δ

–эндотоксина [72].



Иная ситуация описана для гликогенфосфорилазы b: при

повторном прогреве наблюдался пик не только меньший по амп

литуде, но также смещенный на 1,5

o

 в сторону более высоких тем



ператур [17]. В работе, посвященной тепловой денатурации гемо

цианина [36], белок выдерживался в течение часа при температуре,

при которой время полупревращения, рассчитанное на основании

одностадийной модели, составляет 20 мин. Затем образец был

охлажден. Повторный прогрев показал пик меньший по амплитуде

и смещенный на 2,5

o

 в сторону более высоких температур. Это ясно



указывает на то, что механизм тепловой денатурации гликоген

Необратимая тепловая денатурация белков

77

фосфорилазы и гемоциа



нина имеет более сложный

характер, чем одностадийное

превращение.

В работе [93] образцы

глутаматдегидрогеназы наг

ревались до разных тем

ператур (ниже положения

максимума), охлаждались и

сканировались повторно. К

сожалению, в данной работе

не сообщается, как изменя

лось положение максимума

при повторных прогревах.

Авторами была построена

зависимость доли необра

тимо денатурированного

белка (рассчитанного из от

ношения энтальпии при

повторном сканировании к

полной энтальпии) от тем

пературы, до которой образец был прогрет при первом проходе.

Однако полученная интегральная кривая оказалась смещенной в

область более низких температур по сравнению с кривой ДСК.

По–видимому, это связано с тем, что процесс необратимой денату

рации продолжался и при охлаждении. В работах [55, 88] количество

белка, сохранившего свою нативную форму при первом прогреве и

охлаждении также было меньше рассчитанного исходя из односта

дийной модели.

В случае мультидоменных белков или систем, состоящих из

нескольких белков, кривые ДСК могут иметь сложную форму,

включать несколько взаимно перекрывающихся пиков. Для анализа

таких систем для случаев необратимой денатурации в работах

Шнырова и соавторов был развит метод 

«последовательного отжига».

Суть метода состоит в следующем. Вначале получают полную

кривую ДСК, которая дает грубую информацию о числе пиков и

положениях максимума для этих пиков. Далее новый образец того

же состава нагревается в калориметре до температуры на 1–2

o

 выше


положения максимума первого пика (первый скан). Затем образец

охлаждается до начальной температуры и вновь нагревается – на

этот раз до температуры, на 1–2

o

 выше положения максимума



второго пика (второй скан). Вычитая второй скан из первого,

получают восходящую часть кривой, соответствующей первому

Рис. 9. Кривые  ДСК для липазы B при

исходном и повторном сканировании

(скорость сканирования 59,5 град/час)

[88].


      Кружки – исходный прогрев; звез

дочки – повторный прогрев после первого

прогрева до 51,1 °С и охлаждения до 15 °С;

сплошная линия – повторный прогрев,

умноженный на отношение энтальпий

исходного и повторного прогревов.


1   2   3


©stom.tilimen.org 2019
әкімшілігінің қараңыз

    Басты бет