Изучение необратимой тепловой денатурации белков методом дифференциа льной



Pdf көрінісі
бет1/3
Дата24.07.2018
өлшемі390.58 Kb.
  1   2   3

Необратимая тепловая денатурация белков

43

УДК 577.322.037



Успехи биологической химии, т. 40, 2000, с. 43—84

ИЗУЧЕНИЕ  НЕОБРАТИМОЙ

ТЕПЛОВОЙ  ДЕНАТУРАЦИИ  БЕЛКОВ

МЕТОДОМ  ДИФФЕРЕНЦИА ЛЬНОЙ

СК АНИРУЮЩЕЙ  КА ЛОРИМЕТРИИ

А. Е. ЛЮБАРЕВ,  Б. И. КУРГАНОВ



Институт биохимии им. А. Н. Баха РАН, Москва

I. Введение. II. Обратимая и необратимая денатурация белков.

III. Модель одностадийной необратимой денатурации. IV. Откло

нения от одностадийной модели. V. Модель Ламри–Эйринга и

другие двухстадийные модели. VI. Более сложные модели.

VII. Использование повторного сканирования для анализа

калориметрических кривых сложной формы. VIII. Заключение.

I. ВВЕДЕНИЕ

Проблема денатурации белка имеет большое значение как для

фундаментальной, так и для прикладной науки. Изучение процесса

денатурации позволяет установить связь между структурой белка и

его стабильностью и понять, какие факторы определяют стабиль

ность нативной конформации молекулы белка. Считается, что

изучение механизмов денатурации (разворачивания) белковых

молекул представляет также интерес с точки зрения выяснения

механизмов фолдинга (сворачивания) белка [9, 41, 42].

Важность изучения денатурации белка с точки зрения биотех

нологии связана с необходимостью повышения стабильности

биокатализаторов, используемых в биотехнологических процессах,

и с потребностью проводить эти процессы при более высоких

температурах [35]. Медицинское значение проблемы денатурации

и фолдинга белков выросло в последнее время в связи с установ

лением того факта, что причиной ряда смертельно опасных болезней

человека и животных является агрегация белка, которая, в свою

очередь, обусловлена неправильным фолдингом либо дестабили

зацией белковых молекул [99, 106].

Одним из основных методов изучения тепловой денатурации

белков является дифференциальная сканирующая калориметрия

(ДСК). Калориметрия – единственный метод, позволяющий прямо

8 2000 г.


А.Е.Любарев, Б.И.Курганов

44

измерять термодинамические характеристики белков и других



веществ и тем самым изучать энергетику процессов, связанных с

конформационными превращениями белковых молекул. Принципу

метода ДСК и его применению для изучения биохимических

объектов посвящен ряд обзоров [26, 76, 77, 83, 90, 95].

Совершенствование калориметрической техники позволило

получать более точные данные по тепловой денатурации белков.

Так, в ряде работ отмечалось, что при использовании одних калори

метров кривые ДСК содержали экзотермический (отрицательный)

пик, которого не было на кривых, полученных в тех же условиях

для тех же белков, но с использованием более совершенных калори

метров [24, 58, 63].

Следует отметить, что в развитии калориметрической техники

большую роль сыграли работы отечественных ученых и приборо

строителей. Разработанные в Пущино дифференциальные скани

рующие микрокалориметры ДАСМ–1M и ДАСМ–4 широко ис

пользуются во многих странах (см., например, работы [15, 22, 38,

58, 61, 84, 103]).

Однако, для получения наиболее полной информации о теп

ловой денатурации белков, помимо создания точных калориметров,

требуется также разработка математических методов анализа кривых

ДСК. Так, для белков, денатурирующих обратимо и в равновесных

условиях, были разработана методы, позволяющие определить, в

одну или в несколько стадий происходит разворачивание, найти

термодинамические параметры процесса, а также расшифровать

доменную структуру белковых молекул (см. обзоры [7, 57, 73–75,

77, 83, 95]). В то же время для белков, денатурация которых проходит

необратимо, математические методы анализа кривых ДСК начали

разрабатываться лишь около десяти лет назад. К настоящему

времени развитие получила лишь одностадийная необратимая

модель, то есть модель, включающая одну необратимую стадию

1

.

Тем не менее, становится ясно, что данная модель не в состоянии



описать большинство случаев необратимой денатурации белка, и

требуется разработка более сложных моделей. Такая работа в

настоящее время ведется несколькими группами исследователей.

В данном обзоре обсуждаются известные из литературы данные

ДСК для необратимо денатурирующих белков и их анализ в соот

ветствии с моделями необратимой денатурации.

1

 В англоязычной литературе данную модель (как и одностадийную об



ратимую модель) принято называть «моделью двух состояний» (two–state model).

Необратимая тепловая денатурация белков

45

II. ОБРАТИМАЯ И НЕОБРАТИМАЯ ДЕНАТУРАЦИЯ БЕЛКОВ

В 70–е и 80–е годы был накоплен большой опыт по анализу

методами равновесной термодинамики данных ДСК для белков, де

натурация которых в ходе калориметрического эксперимента про

исходит обратимо и в равновесных условиях (см. обзоры [73–75,

77, 83, 95]). Впоследствии, однако, стали появляться данные,

свидетельствующие о необратимом характере тепловой денатурации

ряда белков [24, 32, 40, 58, 80, 84, 85].

Для проверки обратимости денатурации обычно используется

процедура повторного прогрева: образец охлаждается, после чего

заново снимается зависимость теплоемкости от температуры. Если

при этом полностью воспроизводится исходная кривая, очевидно,

что денатурация обратима. Если при повторном сканировании не

наблюдается поглощения тепла (кривая воспроизводит базовую

линию), делается вывод о необратимом характере денатурации.

В ряде случаев при повторном прогреве получаются кривые,

отличающиеся от исходных меньшей величиной максимума избы

точной теплоемкости и, соответственно, меньшим значением

калориметрической энтальпии. В этих случаях часто делается вывод

о частичной обратимости процесса и указывается процент обрати

мости [5, 28, 56, 60, 71]. Следует, однако, иметь в виду, что величина

процента обратимости зависит от ряда факторов: температуры, до

которой образец нагревался в первом эксперименте, скорости

сканирования, скорости (режима) охлаждения. Последний фактор

обычно наименее определен, так как в большинстве микрокалори

метров охлаждение происходит с переменной скоростью.

К сожалению, в литературе практически нет экспериментальных

работ, в которых бы исследовалась зависимость степени обрати

мости от перечисленных выше факторов. В работе Протасевич и

соавт. [78] отмечалось, что степень обратимости тепловой дена

турации апокальмодулина зависела от температуры, до которой

образец нагревался в первом эксперименте: если прогрев оста

навливался немедленно после того, как заканчивался пик тепло

поглощения, степень обратимости была не менее 95%. Следует

отметить также работу Гойнса и Фрейра [32], в которой для пента

мерной формы субъединицы B токсина холеры была проведена

серия последовательных прогревов. Авторы данной работы обна

ружили, что степень обратимости убывает по экспоненциальному

закону в зависимости от времени пребывания образца при тем

пературах выше «температуры перехода», но они не привели

детального описания эксперимента.



А.Е.Любарев, Б.И.Курганов

46

В работе Потехина и Ковригина [6] теоретически исследовалась



обратимая одностадийная денатурация в неравновесных условиях.

Показано, что при высоких скоростях охлаждения большая часть

белка не успевает вернуться в нативное состояние. Таким образом,

принципиально обратимая система при быстром охлаждении может

вести себя как частично (или даже полностью) необратимая. Авторы

сделали вывод, что во многих случаях необратимость в калоримет

рических экспериментах является следствием низкой скорости

ренатурации белка.

Большинство исследователей видит причину необратимости

процесса денатурации в том, что вслед за обратимой стадией

разворачивания (unfolding) следует стадия, в ходе которой молекула

белка подвергается необратимым изменениям [14, 22–24, 51, 58, 63,

64, 68, 84, 87, 93, 100, 103]. Наиболее простой схемой для описания

такого процесса является модель Ламри–Эйринга [53], включающая

последовательно протекающие обратимую и необратимую стадии:

где N, U и D – нативное, частично развернутое и денатурированное

состояния белка, k

1

, k



–1

  и k

2

 – константы скорости соответствую



щих  реакций.

Согласно данным Клибанова и сотр. [44, 104, 107] причиной

необратимых изменений могут быть агрегация, автолиз, химическая

модификация аминокислотных остатков и др.

Модель одностадийной обратимой денатурации можно рассмат

ривать как частный случай модели Ламри–Эйринга. Если в интер

вале температур, в котором происходит разворачивание, скорость

второй стадии мала по сравнению со скоростью разворачивания,

форма N трансформируется в форму U без заметного превращения

последней в форму D. Вторая стадия происходит в интервале

температур, где разворачивание практически закончилось. Если при

этом вторая стадия не сопровождается заметным тепловым эффек

том, кривая ДСК практически не отличается от кривой, описы

ваемой одностадийной обратимой моделью [3, 50, 82].

Если скорость второй стадии велика, модель Ламри–Эйринга

может быть сведена к одностадийной необратимой модели [3, 50, 82]:

В работе Санчез–Руиза [82] рассмотрено две ситуации, когда

это возможно. В первой ситуации значение константы k

2

 значи


тельно превышает значения констант k

1

 и k



—1

, так что прямая



Необратимая тепловая денатурация белков

47

реакция первой стадии является скорость–лимитирующей, а



обратная реакция практически отсутствует (ситуация C' согласно

[82]). В этом случае константа k из модели (2) эквивалентна k

1

 из


модели (1).

Вторая ситуация реализуется, когда скорости прямой и обратной

реакций первой стадии велики по сравнению со скоростью второй

стадии, но равновесие на первой стадии сдвинуто в сторону образо

вания формы N (константа равновесия k

/k



—1

 << 1). В этом

случае константа k из модели (2) эквивалентна k

2

K (ситуация C

согласно [82]).

В ряде работ предпринималась попытка описать методами

равновесной термодинамики кривые ДСК, несмотря на то, что

денатурация была калориметрически необратимой (отсутствовало

теплопоглощение при повторном прогреве) [16, 24, 40, 58, 61, 80,

94, 96, 97]. При этом предполагалось, что процесс денатурации

подчиняется модели Ламри–Эйринга, но необратимая стадия

происходит в интервале температур, где разворачивание практи

чески закончилось (см., например, [24, 58]). Впоследствии Санчез–

Руиз [82] показал, что данные, описанные в работе [58] методами

равновесной термодинамики, гораздо лучше могут быть описаны в

рамках модели Ламри–Эйринга.

Ле Бихан и Жико [48] показали, что данные ДСК для G–актина,

полученные в нескольких работах и интерпретированные в этих

работах в рамках равновесно–термодинамического подхода, соот

ветствуют уравнению, полученному для необратимой односта

дийной модели (см. уравнение (10) в следующем разделе).

При обсуждении вопроса о причинах необратимости дена

турации белков необходимо иметь, как уже отмечалось выше, более

подробные данные о повторном прогреве. Обычно для того, чтобы

можно было корректно вычесть базовую линию, первый прогрев

проводят до температуры, существенно превышающей температуру,

при которой заканчивается пик теплопоглощения. Если после этого

оказывается, что денатурация необратима, необратимость может

быть приписана действию температур, более высоких, чем темпе

ратуры, при которых происходит разворачивание молекулы белка.

Для проверки этого предположения необходимо в последующих

экспериментах останавливать прогрев в момент завершения пика

теплопоглощения или раньше, затем охлаждать и проводить пов

торный прогрев. Так, в работе [55] для случая тепловой денатурации

креатинкиназы нами было показано, что, если остановить прогрев

в момент завершения пика теплопоглощения, при повторном прог

реве теплопоглощения не наблюдается. Более того, если остановить


А.Е.Любарев, Б.И.Курганов

48

прогрев немного не доходя до положения максимума, то при



повторном прогреве воспроизводится лишь 25% теплопоглощения

от исходного прогрева. Такие результаты позволяют сделать одноз

начный вывод о том, что необратимость проявляется уже в ходе

самого процесса разворачивания молекулы белка.

Чтобы проверить, проходит ли процесс денатурации в равно

весных или неравновесных условиях, необходимо использовать

несколько скоростей прогрева (сканирования). В серии работ

Санчез–Руиза и соавт. [21, 22, 28–30, 36, 84, 85] было показано, что

для ряда белков скорость сканирования существенно влияет на

положение максимума на кривых ДСК. Это означает, что процесс

денатурации в данном случае находится под кинетическим конт

ролем. Впоследствии аналогичные результаты были получены и для

многих других белков (см. следующий раздел).

III. МОДЕЛЬ ОДНОСТАДИЙНОЙ НЕОБРАТИМОЙ

ДЕНАТУРАЦИИ

ТЕОРЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ

Теоретический анализ зависимости избыточной теплоемкости

от температуры в рамках модели (2) был проведен в ряде работ [21,

22, 26, 46, 83, 84]. Предполагается, что константа скорости k

подчиняется уравнению Аррениуса:



k  = A exp(–E

a

/RT ),



(3)

где A – предэкспоненциальный множитель, E

a

 – энергия активации,



R – универсальная газовая постоянная, T – абсолютная температура.

Удобнее записывать уравнение Аррениуса в другой форме [21, 46, 82]:



 =  exp{(E

/R)(1/T



*

 – 1/)},

(4)

где T



*

 – абсолютная температура, при которой = 1 мин

—1

. Кроме


того, используется допущение, что параметры уравнения Аррениуса

E

a

 и T



*

, а также энтальпия денатурации 



H не зависят от темпе

ратуры.


Кинетическое поведение системы, удовлетворяющей данной

модели, при постоянной скорости изменения температуры (ско

рости сканирования) 

ν

= d/ dt  (t – время) описывается диффе



ренциальным уравнением:

d

γ



N

/dT = –(1/v)k

γ

N

 ,



(5)

где 


γ

N

 – доля молекул белка, находящихся в нативной форме.



Решение данного уравнения может быть получено в виде выражения:

Необратимая тепловая денатурация белков

49

Интеграл в уравнении (6) не имеет аналитического решения и



должен вычисляться с помощью численных методов.

Текущее количество теплоты (Q), поглощаемое в процессе

денатурации, может быть определено из уравнения:

Q = (1 – 

γ

N



)



H,

(7)

а избыточная теплоемкость (C



p

ex

) – из уравнения:



C

p

ex



 = d/dT  = k

γ

N





H/

ν

.



(8)

Из уравнений (6)–(8) можно получить следующее выражение для

избыточной теплоемкости [46]:

Зависимость избыточной теплоемкости от температуры имеет

форму кривой с максимумом (см. рис. 1). Пик обладает ярко выра

женной асимметрией. Оказалось, что степень асимметрии пика

(отношение площадей левой и правой частей пика) практически

не зависит от параметров модели и приблизительно равно e–1, т.е.

~1,72 [2, 6].

Рис. 1. Теоретические зависи

мости избыточной теплоем

кости от температуры, пост

роенные на основании урав

нения (9) [26].

   



= 800 кДж/моль, E



a

= 300


кДж/моль, ln= 108,3 (T

*

= 333,2



К). Значения скорости сканиро

вания приведены над кривыми.



А.Е.Любарев, Б.И.Курганов

50

Как видно из уравнения (9), зависимость избыточной теплоем



кости от температуры определяется скоростью сканирования,

энтальпией денатурации и двумя параметрами уравнения Арре

ниуса. При этом энтальпия денатурации не влияет на форму кривой,

а играет роль масштабного коэффициента. Энергия активации

определяет в первую очередь ширину пика (чем больше энергия

активации, тем уже пик), в то время как положение максимума

зависит, главным образом, от значений параметра T

*

 и скорости



сканирования.

Санчез–Руиз и соавт. [84] получили следующее выражение,

связывающее положение максимума (T

m

) с параметрами модели:



ν

/T

m

2

 = (AR /E



a

) exp(–E

a

 /RT



m

).

(10)



Преобразовав данное уравнение, получаем:

Расчеты показывают, что значения знаменателя в уравнении (11)

в интервале значений энергии активации 200

÷

500 кДж/моль, пара



метра T

*

 323



÷

353 K и скорости сканирования 0,1

÷

2 K/мин состав



ляют 1

÷

1,05. Увеличение скорости сканирования в 



α

 раз приводит

к сдвигу положения максимума в сторону более высоких температур,

который составляет



T

m

 = (0,9



÷

1){(T

*

)

2



/(E

a

/R)} ln



α

(12)


градусов. Так, при E

a

 = 300 кДж/моль и T



*

= 333,16 K увеличение

скорости сканирования в 2 раза приводит к сдвигу примерно на 2

градуса.


Санчез–Руиз и соавт. [84] получили также приближенное

уравнение, связывающее положение максимума (T

m

) с максималь



ным значением избыточной теплоемкости (C

p  ,


ex

max


):

E

a

 = eRC



 ,

ex



max

T

m

2



/



H.

(13)

Из этого уравнения следует, что сдвиг положения максимума в



сторону более высоких температур, связанный с увеличением

скорости сканирования, должен сопровождаться небольшим сни

жением максимального значения избыточной теплоемкости (при

мерно на 1% при сдвиге на 2 градуса).



Необратимая тепловая денатурация белков

51

МЕТОДЫ РАСЧЕТА ПАРАМЕТРОВ МОДЕЛИ



ИЗ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ КРИВЫХ

Энтальпия денатурации может быть легко вычислена как

площадь под кривой зависимости избыточной теплоемкости от

температуры. Для определения параметров уравнения Аррениуса

из экспериментальных кривых, удовлетворяющих одностадийной

необратимой модели, требуется более сложная процедура.

Санчез–Руиз и соавт. [84] предложили 4 способа расчета энергии

активации.

1. Значение энергии активации может быть получено для каждой

кривой прямым вычислением по формуле (13), исходя из максималь

ного значения избыточной теплоемкости и значения температуры,

при которой избыточная теплоемкость достигает максимума.

2. Зная значения T

m

, полученные при разных скоростях скани



рования, можно, в соответствии с уравнением (10), определить

отношение  E

a

/R как тангенс угла наклона зависимости ln (



ν

/T

m

2

)



от  1/T

m

.



3.  Санчез–Руиз и соавт. получили следующее выражение для

константы скорости:



ν

C

p  

ex 


(



H – Q) .

(14)

Учитывая уравнения (3) и (14), отношение E



a

/R может быть опре

делено как тангенс угла наклона зависимости ln [

ν

C

p

ex

/(





– Q)]

от 1/.

4. Санчез–Руиз и соавт. получили приближенное выражение,

связывающее величину Q с температурой:

ln {ln[



H/(





H

 

– Q)]} = E



a

/R(1/T

m

 – 1/) .



(15)

С учетом этого уравнения отношение E

a

/R может быть опреде



лено для каждой кривой как тангенс угла наклона зависимости

ln {ln [




/ (



– Q)]}  от 1/.

Позже было получено приближенное уравнение зависимости

избыточной теплоемкости от температуры:



C

p  


ex

 = eC

p  ,

ex

max



exp[E

a

(T – T



m

)/(RT

m

2

)]



x

exp{– exp[E



a

(T – T

m

)/(R T



m

2

)]},



(16)

и был предложен пятый способ, основанный на приближении

данного уравнения к экспериментальной кривой с помощью

нелинейного метода наименьших квадратов [21, 22]

1

.

1



 В работе [21] использовался другой вариант уравнения (16), где вместо

eC

ex

p, max



  было записано 



HE

a

/(RT



m

2

). Этот же вариант приводится в обзоре [83].



А.Е.Любарев, Б.И.Курганов

52

Большинство из перечисленных способов обладают сущест



венными недостатками. Способы 1 и 2 используют лишь одну точку

из каждой экспериментальной кривой, что снижает надежность

получаемых результатов. Способы 4 и 5 основаны на приближенных

уравнениях, которые соответствуют модели лишь вблизи положения

максимума, поэтому они плохо описывают начальный и конечный

участки кривой. Кроме того, способы 1, 2, 4 и 5 позволяют опре

делить лишь один из параметров уравнения Аррениуса (энергию

активации), в то время как значение другого параметра (A или T

*

)

с помощью данных способов определить не удается.



Наиболее ценным из перечисленных способов является

способ 3, основанный на использовании уравнений (3) и (14).

Одно из преимуществ этого способа состоит в том, что значение

ln[


ν

C

p

ex



(



– Q)] в случае выполнимости одностадийной модели

не должно зависеть от скорости сканирования. Поэтому точки,

полученные при разных скоростях сканирования, должны лежать

на одной прямой. Таким образом, данный способ позволяет однов

ременно использовать все экспериментальные данные.

Другое достоинство данного способа – возможность вычисления

не только энергии активации, но и второго параметра уравнения

Аррениуса. Натуральный логарифм предэкспоненциального мно

жителя A может быть определен по пересечению графика {ln[

ν

C

p

ex



/

(



– Q)]; 1/} с осью ординат или методом линейной регрессии.

Однако, более целесообразно использовать вместо A другой пара

метр (T

*

) в соответствии с уравнением (4). В этом случае на осно



вании уравнений (4) и (14) можно записать следующую зависимость:

1/= 1/T

*

 – ln[


ν

C

p

ex



/(



– Q)] /(E

a

/R).



(17)

На основании данного уравнения 1/T

*

 и E



a

/R могут быть опреде

лены методом линейной регрессии или из графика зависимости 1/T

от ln [


ν

C

p

ex



/(



– Q)] : E

a

/R – как котангенс угла наклона прямой,



а 1 /T

*

 – как точка пересечения прямой с осью ординат. Значения



энергии активации, определяемые на основании либо уравнения

(17), либо уравнений (3) и (14) практически не отличаются друг от

друга в пределах точности метода. Значения параметра T

*

 может



быть определено на основании уравнения (17) с гораздо большей

точностью, чем значение параметра A на основании уравнений (3)

и (14). Кроме того, параметр T

*

 имеет более ясный физический



смысл, чем параметр A.

Одним из недостатков данного способа является необходимость

предварительного вычисления значений Q путем интегрирования

зависимости C

p

ex

 от T до текущего значения температуры. В прин



Необратимая тепловая денатурация белков

53

ципе, при наличии соответствующего программного обеспечения



значения Q могут быть легко получены для большого числа экспе

риментальных точек. Однако, в большинстве работ, где применялся

данный метод, использовалось весьма ограниченное число экспе

риментальных точек (5–7), что снижало точность расчета.

Следует также отметить, что сильные флуктуации значений

избыточной теплоемкости в начальной и конечной части кривой

(характерные для кривых ДСК) могут приводить к систематической

ошибке при определении значений Q и 



и тем самым искажать

результаты расчетов. Кроме того, незначительные колебания

значений  C

p

ex



 вблизи нулевого значения (в начальной и конечной

части кривой) приводят к большим изменениям в значениях

ln[

ν

C



p

ex

/(





– Q)], поэтому приходится ограничивать используемый

интервал экспериментальных точек. Мы обычно используем все

экспериментальные точки в интервале значений Q между 5 и 95%

от 




H.

Еще один недостаток метода связан с тем, что для поиска

оптимальных значений параметров приходится минимизировать

отклонения рассчитанных значений функции не от экспери

ментальной кривой, а от ее линейной анаморфозы. При этом

небольшим отклонениям между экспериментальным и теоре

тическим значениями функции на линейном графике могут соответ

ствовать заметные отклонения на графике зависимости C

p

ex

 от T,



особенно вблизи положения максимума.

Последний недостаток может быть исправлен, если исполь

зовать аппроксимацию экспериментальных кривых уравнением

C

p

ex



 = (1/

ν

)(





H – Q) exp{(E

a

/R)(1/T



*

 – 1/)}

(18)

с помощью нелинейного метода наименьших квадратов [46]. Кроме



того, данный способ не чувствителен к флуктуациям в начальной и

конечной части экспериментальной кривой. Однако, сохраняется

недостаток, связанный с возможностью систематической ошибки

при определении значений Q и 



H. Следует отметить, что Q исполь

зуется в уравнении (18) как независимая переменная, в то время

как фактически ее значение рассчитывается, исходя из значений

зависимой переменной C

p

ex

. Кроме того, в данном случае 





H не

может быть использован как независимый параметр, поскольку

используется разность 



– .

В работе [46] дифференцированием зависимости lnC

p

ex



 от 1/T

получено уравнение:

d(lnC

p

ex



)/d(1/) = (1/

ν

)T



2

exp{(E

a

/R)(1/T



*

 – 1/)} –

                    – E

a

 /R .



(19)

А.Е.Любарев, Б.И.Курганов

54

В соответствии с данным уравнением параметры E



a

 и T

*

 могут быть



определены нелинейным методом наименьших квадратов из зависи

мости d(lnC

p

ex

)/d(1/) от 1/, которая может быть получена матема



тической обработкой исходной кривой ДСК. Достоинством данного

метода является отсутствие необходимости предварительного вычис

ления значений Q. Однако, данный метод чувствителен к флуктуациям

в начальной и конечной части экспериментальной кривой.

Наиболее точным и удобным является, на наш взгляд, способ,

основанный на аппроксимации экспериментальных кривых урав

нением (9) с помощью нелинейного метода наименьших квадратов

[46]. Этот способ практически не чувствителен к флуктуациям в

начальной и конечной частях экспериментальной кривой. Вместо

переменной  , которая должна вычисляться интегрированием

экспериментальной кривой, используется интеграл теоретической

зависимости k от T, который (в отличие от Q) может быть вычислен

с любой степенью точности. Нет необходимости также предва

рительно вычислять значение 



H, поскольку оно может быть

получено в результате аппроксимации вместе с параметрами E

a

  и


T

*

. Кроме того, все параметры в уравнении (9), кроме 



ν

, являются

общими для всех экспериментальных кривых, поэтому данный

способ позволяет проводить аппроксимацию одновременно нес

кольких экспериментальных кривых, полученных при разных

скоростях сканирования [54, 55].

К недостаткам метода можно отнести то, что большинство

широко используемых калориметристами программных продуктов

(например, программный пакет Microcal Origin) не позволяет

проводить аппроксимацию с помощью уравнений, содержащих

интеграл. Нами была разработана специальная программа, позво

ляющая определять данным методом параметры одностадийной

модели [46, 54].

Возможен и другой способ, который основан на аппроксимации

экспериментальных данных непосредственно с помощью диф

ференциального уравнения (5) и уравнения (8). Этот способ

использовался в некоторых работах [51, 55, 63]. Способ также требует

сложного программного обеспечения.

В работах Майлса и соавт. [66, 67] одностадийная необратимая

модель анализировалась в рамках предположения, что темпера

турная зависимость константы скорости подчиняется не уравнению

Аррениуса, а уравнению теории переходного состояния:



Необратимая тепловая денатурация белков

55

где k



B

 – постоянная Больцманаh – постоянная Планка, 



S

#

 и 





H

#



энтропия и энтальпия переходного состояния. Авторы анализи

ровали данные ДСК для коллагена с использованием как уравнения

Аррениуса, так и уравнения (20) и пришли к выводу, что различия

между двумя вариантами несуществены.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ДАННЫЕ, ОПИСАННЫЕ В РАМКАХ

ОДНОСТАДИЙНОЙ НЕОБРАТИМОЙ МОДЕЛИ

В настоящее время известно более двух десятков белков, тепло

вая денатурация которых была описана в рамках одностадийной

необратимой модели. Данные об этих белках и результаты расчета

параметров процесса денатурации (изменения энтальпии и энергии

активации) приведены в табл. 1. В табл. 2 приведены результаты

расчета энергии активации, полученные разными методами.

К сожалению, в большинстве работ не приводятся результаты

расчета второго параметра уравнения Аррениуса (A или T

*

). Значе


ния параметра T

*

 приведены только для карбоксипептидазы B в



присутствии Zn

2+

 [21], аннексина V [103], ацетилхолинэстеразы и



целлюлазы [46], лектина из чечевицы [46, 59], липазы B [88] и

креатинкиназы [55]. Значения параметра A приведены для G–

актина [48] и бромелаина [14].

Согласно Привалову [7], энтальпия денатурации определяется

главным образом температурой и молекулярной массой белка. При

110


o

С энтальпия денатурации большинства белков составляет

примерно 6 кДж на моль аминокислотного остатка. При 50

o

С



энтальпия денатурации белков находится в пределах 1,5

)3 кДж на

моль аминокислотного остатка или 14

)28 Дж/г, а при 75

o

С – 31


)38

Дж/г. В более позднем обзоре Махатадзе и Привалова [57] нижние

пределы практически не изменились, а верхние пределы увеличились.

Однако, значения энтальпии денатурации, приведенные в табл.

1, в основном ниже данных Привалова или находятся в районе

нижней границы. Большинство белков, представленных в таблице,

можно разделить на две группы. В первой группе (в основном это бел

ки, денатурация которых наблюдалась при температурах 40

)60 

o

С)



удельная энтальпия составляет 12

)15 Дж/г, во второй (в основном

это белки, денатурация которых наблюдалась при температурах

60

)80 



o

С) – 18


)23 Дж/г. Для термолизина и супероксиддисмутазы,

денатурация которых наблюдалась при температурах 80

)100

o

С,



удельная энтальпия составляет 35

)40 Дж/г. Аномально низкое зна

чение удельной энтальпии (7,5 Дж/г) получено для АТФ–синтазы.


А.Е.Любарев, Б.И.Курганов

56


Необратимая тепловая денатурация белков

57

Разброс значений удельной энергии активации получился



гораздо сильнее, чем разброс значений энтальпии денатурации. Для

высокомолекулярных белков значения удельной энергии активации

оказываются наиболее низкими: 0,8

)0,9 Дж/г для гемоцианина,

глутаматдегидрогеназы и комплекса F

1

; 1,3



)1,6 Дж/г для лактат

дегидрогеназы, АТФазы и АТФ–синтазы. Для группы белков с

молекулярной массой 32

)48 кДа (термолизин, карбоксипептидаза

A, прокарбоксипептидаза и карбоксипептидаза B, супероксиддис

мутаза и лектин из чечевицы) значения удельной энергии активации

составили 7

)8 Дж/г. Максимальное значение удельной энергии

активации получено для наименьшего из приведенных в таблице

белков, цитотоксина RTX–8 – 24,8 Дж/г .

Таблица 2




Достарыңызбен бөлісу:
  1   2   3


©stom.tilimen.org 2019
әкімшілігінің қараңыз

    Басты бет