Iotest® IgG1-pc5 Изотипический контроль каталожный номер

100 тестов; 1 мл

10 мкл / тест



IOTest

Конъюгаты антител
ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ
IN VITRO

	Спецификации
Специфичность
Клон	679.1Mc7
Гибридома	P3-X63-Ag.8.653 x Balb/c
Иммуноген	Небиологический гаптен
Иммуноглобулин	IgG1
Вид животных	Мышь
Источник	Асциты
Способ очистки	Аффинная хроматография с иммобилизованным белком A
Флуорохром	Фикоэритрин R - Цианин 5.1 (PС5)
λ возбуждения	488 нм
Пик эмиссии	670 нм
Буфер	PBS pH 7.2, БСА 2 мг/мл, 0.1% NaN3

НАЗНАЧЕНИЕ

Изотипический контроль из группы реагентов IOTest, приготовленный на основе конъюгатов мышиного IgG1 с PС5, используется при выполнении анализа образцов крови человека на проточных цитофлуориметрах. Он позволяет определить неспецифическое окрашивание лейкоцитов и тромбоцитов.

Анализ основан на способности специфических моноклональных антител связываться с антигенными детерминантами на поверхности лейкоцитов и тромбоцитов.

При инкубации образца со специфическим реагентом IOTest происходит окрашивание клеток. Затем выполняется лизис эритроцитов. Интактные лейкоциты или тромбоциты анализируются на проточном цитофлуориметре.

Проточный цитометр измеряет светорассеяние и флуоресценцию клеток. Он позволяет выделить интересующую популяцию на диаграмме, отображающей светорассеяние в боковом направлении (Side Scatter или SS) и светорассеяние в прямом направлении под малыми углами (Forward Scatter или FS). Для выбора анализируемых популяций можно использовать и другие двупараметровые диаграммы в зависимости от используемого приложения.

Диаграмма FS - SS позволяет отсеять разрушенные клетки и отделить лимфоциты от моноцитов и полиморфно-ядерных клеток. Выделение интересующей популяции программными средствами используется для создания однопараметровой гистограммы (количество клеток - интенсивность флуоресценции). Таким образом можно распознать окрашенные и неокрашенные клетки. Результат представляется в виде процентного содержания положительных клеток от всех клеток выбранной популяции.
ПРИМЕРЫ КЛИНИЧЕСКОГО ПРИМЕНЕНИЯ

Стадии дифференцировки кроветворных клеток характеризуются экспрессией или отсутствием экспрессии поверхностных антигенов, которые идентифицируются с помощью специфичных моноклональных антител. Одна из трудностей при анализе этих антигенов - неспецифическое связывание конъюгатов антител при окрашивании, выраженное в большей или меньшей степени. Для точного определения положительных клеток необходимо принимать в расчет данное неспецифическое связывание (1, 2).

Изотипический контроль IOTest служит для определения неспецифического связывания моноклональных антител того же изотипа, конъюгированных с фикоэритрином R - цианином 5.1 (PС5) и принадлежащих к группе реагентов IOTest.

В зависимости от сигнала, полученного при анализе изотипического контроля, для каждой целевой популяции следует изменить границы между отрицательными и положительными событиями.

До и после распечатки флакона жидкие конъюгаты антител необходимо хранить при температуре 2 - 8°C в защищенном от света месте.

Стабильность нераспечатанного реагента приводится на этикетке флакона.

Стабильность распечатанного реагента 30 дней.

1. 
   Не используйте реагент с истекшим сроком годности.
   
2. 
   Не замораживайте реагент.
   
3. 
   Перед использованием необходимо уравновесить реагент при комнатной температуре (18–25°C).
   
4. 
   Воздействие света необходимо свести к минимуму.
   
5. 
   Избегайте контаминации микроорганизмами, в противном случае возможно получение недостоверных результатов.
   
6. 
   Растворы антител, содержащие азид натрия (NaN₃), требуют осторожного обращения. Не проглатывайте, избегайте любого контакта с кожей, слизистой оболочкой и глазами. В кислой среде азид натрия способен образовывать взрывоопасную азотисто-водородную кислоту. При утилизации перед сливом в водопровод рекомендуется развести реагент большим объемом воды. Это позволит избежать накопления азида натрия в металлических трубах и предотвратит образование взрывчатого вещества.
   
7. 
   Все образцы крови следует рассматривать как потенциально инфицированные. При работе с ними необходимо соблюдать все меры предосторожности (в частности, использовать защитные перчатки, халат и очки).
   
8. 
   Никогда не отбирайте образец через пипетку ртом. Избегайте контакта образца с кожей, слизистой оболочкой и глазами.
   
9. 
   После завершения работы пробирки с кровью и все одноразовые материалы необходимо поместить в специальные контейнеры для утилизации.
   

Венозную кровь или образцы костного мозга необходимо отобрать в стерильные пробирки с солью EDTA в качестве антикоагулянта. Использование других антикоагулянтов не рекомендуется.

Образцы должны храниться при комнатной температуре (18 – 25°C). Встряхивание образцов не допускается. Перед отбором аликвоты образец следует гомогенизировать, аккуратно перемешав.

Анализ образцов необходимо выполнить в течение 24 часов после отбора.

• 
  Пробирки и материалы для отбора проб.
  
• 
  Автоматические пипетки с одноразовыми наконечниками на 10, 100 и 500 мкл.
  
• 
  Пластиковые пробирки для гемолиза.
  
• 
  Калибровочные частицы: флуоросферы Flow-Set™ (кат. № 6607007).
  
• 
  Реагент для лизиса эритроцитов (с предусмотренной стадией отмывки после лизиса). Например: VersaLyse (кат. № A09777).
  
• 
  Реагент для фиксации лейкоцитов. Например: IOTest 3 Fixative Solution (кат. № A07800).
  
• 
  Специфические антитела, конъюгированные с PС5, из группы реагентов IOTest.
  
• 
  Буфер (PBS: 0.01 M фосфат натрия; 0.145 M хлорид натрия; pH 7.2).
  
• 
  Центрифуга.
  
• 
  Миксер (вортекс).
  
• 
  Проточный цитофлуориметр.
  

При исследовании любого образца необходимо также проанализировать контрольный образец. Изотипический контроль IgG1-PС5 (кат. № A07798) адаптирован для анализа с использованием антител IOTest, конъюгированных с PС5.

1. 
   В пробирки для анализа клинических образцов добавьте по 10 мкл конъюгатов антител, а в пробирки для анализа контролей – по 10 мкл изотипического контроля IgG1-PС5.
   
2. 
   В пробирки для анализа образца и для анализа изотипического контроля добавьте по 100 мкл образца. Аккуратно перемешайте на вортексе.
   
3. 
   Инкубируйте в течение 15 - 20 минут при комнатной температуре (18 – 25°C) в защищенном от света месте.
   
4. 
   Если требуется, выполните лизис эритроцитов, следуя рекомендациям изготовителя лизирующего реагента.
   

Если образец не содержит эритроцитов, добавьте 2 мл PBS.

5. 
   Отцентрифугируйте в течение 5 минут при 150 x g при комнатной температуре.
   
6. 
   Удалите супернатант аспирацией.
   
7. 
   Ресуспендируйте осадок клеток в 3 мл PBS.
   
8. 
   Повторите шаг 5.
   
9. 
   Удалите супернатант аспирацией и ресуспендируйте клетки:
   

− в 0.5 или 1 мл PBS без формальдегида, если подготовленная проба будет проанализирована в течение 2 часов.

Моноклональные антитела 679.1Mc7 принадлежат к подклассу IgG1. Они не связываются специфически с какими-либо поверхностными дифференцировочными антигенами лейкоцитов и тромбоцитов человека.

В один день на одном цитометре определялась средняя интенсивность флуоресценции (СИФ) отрицательных клеток в образце цельной крови взрослого человека. Измерение выполнялось 12 раз. Полученные результаты суммированы в следующей таблице:

В один день на двух цитометрах двумя лаборантами определялась средняя интенсивность флуоресценции (СИФ) отрицательных клеток (лимфоцитов, моноцитов и гранулоцитов). Измерение выполнялось 12 раз. Полученные результаты суммированы в следующих таблицах:

Цитометр # 2

1. 
   При неправильной настройке цитофлуориметра, неверной компенсации флуоресценции и неправильном расположении регионов могут быть получены недостоверные результаты.
   
2. 
   Рекомендуется выполнять лизис эритроцитов с отмывкой, поскольку данный реагент не оптимизирован для процедуры без отмывки.
   
3. 
   Для получения точных и воспроизводимых результатов необходимо соблюдать все приведенные инструкции и нормы лабораторной работы.
   
4. 
   Антитела данного реагента откалиброваны для получения наилучшего соотношения специфического и неспецифического сигнала. Поэтому в каждом исследовании необходимо строго дозировать указанный объем реагента с учетом количества клеток в образце.
   
5. 
   При гиперлейкоцитозе разведите образец PBS так, чтобы получить примерную концентрацию лейкоцитов 5 x 10⁹/л.
   
6. 
   При некоторых заболеваниях, таких как тяжелая почечная недостаточность или гемоглобинопатии, лизис эритроцитов может происходить медленно, не полностью или совсем не происходить. В этом случае перед окрашиванием рекомендуется выделить мононуклеарные клетки в градиенте плотности (например, фикола).
   

В приложении приводится список литературы и примеры диаграмм.

Логотип Beckman Coulter, COULTER, EPICS, EXPO, Flow-Set, IOTest, System II, XL являются зарегистрированными торговыми знаками компании Beckman Coulter Inc.

IMMUNOTECH S.A.

a Beckman Coulter Company

130 avenue de Lattre de Tassigny

B.P. 177 – 13276 Marseille Cedex 9

France

Ниже показаны однопараметровые гистограммы (количество клеток – интенсивность флуоресценции), полученные при анализе лизированного образца нормальной цельной крови. Для окрашивания использовался изотипический контроль IOTest IgG1-PC5 Isotypic Control (кат. № A07798). Выполнялось выделение лимфоцитов программными средствами.

Гистограмма 2. Считывание данных выполнено с помощью проточного цитофлуориметра Becton Dickinson FACScan™.

1. 
   Borowitz, M., Bauer, K.D., Duque, R.E., Horton, A.F., Marti, G., Muirhead, K.A., Peiper, S., Rickman, W., "Clinical applications of flow cytometry: Quality assurance and immunophenotyping of lymphocytes; approved guideline", 1998, NCCLS, 21, 18.
   
2. 
   Stewart, C.C., Stewart, S.J., "Cell preparation for the identification of leukocytes", 1994, Methods Cell Biol., Chap 3, 41, 39-60.