Генотипирование крупного рогатого скота по генам бета-лактоглобулина и каппа-казеина методами днк-технологии



бет1/4
Дата04.07.2018
өлшемі417.94 Kb.
#77675
түріАвтореферат
  1   2   3   4



На правах рукописи


ЗАРИПОВ ОЛЕГ ГАЯЗОВИЧ


ГЕНОТИПИРОВАНИЕ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА

ПО ГЕНАМ БЕТА-ЛАКТОГЛОБУЛИНА И КАППА-КАЗЕИНА

МЕТОДАМИ ДНК-ТЕХНОЛОГИИ

Специальность: 03.01.04 – биохимия




АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук
Казань – 2010

Работа выполнена в ФГОУ ВПО «Казанская государственная академия ветеринарной медицины имени Н.Э. Баумана»



Научный руководитель: кандидат биологических наук, доцент

Ахметов Тахир Мунавирович
Официальные оппоненты: доктор ветеринарных наук, профессор

Хазипов Нариман Залилович
кандидат биологических наук, доцент

Бабынин Эдуард Викторович


Ведущая организация: ФГНУ «Всероссийский научно-исследовательский

институт племенного дела», Московская область,

Пушкинский р-н, п. Лесные Поляны.
Защита состоится 25 марта 2010 года в 13:00 ч. на заседании диссертационного совета Д.212.081.08 при Казанском государственном университете им. В.И. Ульянова-Ленина по адресу: 420008, г. Казань, ул. Кремлевская, 18.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке им. Н.И. Лобачевского Казанского государственного университета им. В.И. Ульянова-Ленина.


Автореферат разослан «___»________ 2010 г.


Ученый секретарь

диссертационного совета,

доктор биологических наук, профессор Абрамова З.И.



1. Общая характеристика работы

Актуальность. В связи с заинтересованностью перерабатывающих предприятий молочной промышленности в закупках качественного сырья для производства белковомолочной продукции, возникла потребность в привлечении современных молекулярно-генетических методов диагностики в животноводство для улучшения технологических свойств молока.

Процесс производства высококачественного сыра и творога возможен лишь при условии, что молоко направляемое на их выработку является сыропригодным. т.е. способно образовывать плотный казеиновый сгусток под действием сычужного фермента.

Для производства пастеризованных и стерилизованных продуктов молоко подвергается обработке с использованием высоких температур. Поэтому, проблема повышения термостабильности белков молока также является особо актуальной.

Опыт многих стран свидетельствует об использовании в животноводстве генетических маркеров, связанных с качественными признаками молочной продуктивности. Одними из таких маркеров являются гены бета-лактоглобулина и каппа-казеина (Л.А. Калашникова, 2003).

Ген каппа-казеин – один из немногих известных генов, однозначно связанный с признаками белковомолочности и технологическими свойствами молока. В-аллель гена каппа-казеина ассоциирован с более высоким содержанием белка в молоке, более высоким выходом творога и сыра, а также лучшими коагуляционными свойствами молока. Практика показывает, что высококачественные твёрдые сыры могут быть изготовлены только из молока, полученного от коров, имеющих генотип ВВ каппа-казеина. Хотя многими учеными установлено влияние гена бета-лактоглобулина на биохимические и технологические характеристики молока, нет единого мнения какой из аллелей, А или В наиболее предпочтителен.

В настоящее время генотипирование животных все больше связывают с работами в области ДНК-технологий, что позволяет идентифицировать генотипы молочных белков у маточного поголовья, производителей и молодняка (О.В. Костюнина, 2005).



Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы является разработка и усовершенствование способов определения аллельного полиморфизма генов бета-лактоглобулина и каппа-казеина у крупного рогатого скота на основе метода полимеразной цепной реакции.

В соответствии с целью работы для решения были поставлены следующие задачи:

– Оптимизировать технику выделения ДНК из крови и спермы крупного рогатого скота для молекулярно-генетических исследований.

– Оптимизировать технику ПЦР-ПДРФ для генотипирования крупного рогатого скота по генам бета-лактоглобулина и каппа-казеина; разработать новые способы проведения ПЦР.

– Определить частоту встречаемости аллельных вариантов и генотипов бета-лактоглобулина и каппа-казеина у крупного рогатого скота с использованием ДНК-анализа.

– Оценить молочную продуктивность коров с разными генотипами бета-лактоглобулина.

– Изучить качество и технологические свойства молока коров с разными генотипами бета-лактоглобулина.

Научная новизна. Оптимизированы технические приемы выделения ДНК из крови и спермы и способы проведения ПЦР-ПДРФ для генотипирования крупного рогатого скота по генам каппа-казеина и бета-лактоглобулина.

Разработаны способы проведения высокоточной и аллель-специфичной ПЦР для генотипирования крупного рогатого скота по аллелям А и В гена каппа-казеина» с оптимизированной техникой 2-х стадийной ПЦР.



Практическая значимость. Оптимизированные технические приемы пробоподготовки нуклеиновых кислот и ПЦР-ПДРФ-анализа для генотипирования крупного рогатого скота по генам бета-лактоглобулина и каппа-казеина позволяют осуществлять достоверную оценку их аллельного полиморфизма.

Разработанные и предложенные подходы проведения высокоточной и аллель-специфичной ПЦР для генотипирования крупного рогатого скота по аллелям А и В гена каппа-казеина с оптимизированной техникой 2-х стадийной ПЦР позволяют осуществлять эффективную экспресс-идентификацию аллельных вариантов АА, АВ, ВВ гена CSN3.



Апробация работы. Основные положения диссертации доложены на:

– ежегодных итоговых заседаниях ученых советов ФГОУ ВПО «Казанская государственная академия ветеринарной медицины им. Н.Э. Баумана (2007-2009 гг.);

– всероссийской научно-практической конференции «Технологические и технические аспекты развития сельского хозяйства», посвященной 85-летию КГАУ (Казань, 2007 г.);

– международной научно-практической конференции «Современные подходы развития АПК», посвященной 135-летию КГАВМ им. Н.Э. Баумана (Казань, 2008 г.).



Публикация результатов исследования. По теме диссертации опубликовано 9 научных статей, в том числе 4 в ведущих рецензируемых научных журналах, рекомендованных ВАК. Получен 1 патент РФ на изобретение.

Основные положения, выносимые на защиту.

– Технические приемы выделения нуклеиновых кислот и проведения ПЦР-ПДРФ, оптимизированные для генотипирования крупного рогатого скота по генам бета-лактоглобулина и каппа-казеина, являются эффективными инструментами ДНК-анализа аллельного полиморфизма.

– Способы проведения высокоточной и аллель-специфичной ПЦР, разработанные для генотипирования крупного рогатого скота по аллелям А и В гена каппа-казеина в оптимизированной технике 2-х стадийной ПЦР, обеспечивают эффективную наработку специфичных ампликонов и позволяют осуществлять достоверную экспресс-идентификацию искомых генотипов.

– Определены частоты встречаемости желательных аллелей и генотипов по генам бета-лактоглобулина и каппа-казеина крупного рогатого скота, влияющие на молочную продуктивность, состав и физико-химические показатели молока;

А-аллель гена бета-лактоглобулина оказывает положительное влияние на молочную продуктивность коров (удой, содержание белка, лактозы и сухих веществ в молоке); молоко таких коров характеризуется повышенной термостабильностью, тогда как В-аллель гена бета-лактоглобулина улучшает сыродельческие свойства молока.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 130 страницах компьютерного текста (текстовый редактор «Microsoft Word 2003», стиль «Times New Roman», размер шрифта 14 пт, интервал полуторный) и включает: введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты собственных исследований, обсуждение результатов исследования, выводы, практические предложения, список использованной литературы (всего 232 источника, в том числе 159 иностранных) и приложения. Диссертация иллюстрирована 14 таблицами и 20 рисунками.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследования по теме диссертации проводились в период с 2006 по 2009 гг. на кафедре технологии животноводства ФГОУ ВПО «Казанская государственная академия ветеринарной медицины имени Н.Э. Баумана», в ФГУ «Татарская межрегиональная ветеринарная лаборатория», ООО «Дусым» Атнинского района, а также в ГУП головном племенном предприятии «Элита» Высокогорского района Республики Татарстан.

Для определения полиморфизма гена бета-лактоглобулина и оценки хозяйственно-полезных признаков у животных с разными генотипами бета-лактоглобулина, было отобрано в ООО «Дусым» 158 черно-пёстро х голштинских коров. Наряду с этим, для определения полиморфизма гена бета-лактоглобулина и каппа-казеина были отобраны 70 быков-производителей в ГУП ГПП «Элита». В нашем исследовании использовались как чистопородные, так и помесные по голштинской породе быки-производители, все быки имели комплексный класс элита-рекорд. Оценку полиморфизма генов бета-лактоглобулина и каппа-казеина проводили на основе полимеразной цепной реакции (ПЦР). Для дальнейшего исследования согласно принципа аналогов (А.И. Овсянников, 1976), по результатам генотипирования по гену бета-лактоглобулина были сформированы 3 группы черно-пёстро х голштинских коров. В первую группу включены первотёлки с генотипом бета-лактоглобулина ВВ (контрольная группа), во вторую – генотипом АВ, в третью – генотипом АА.

Наряду с экспериментальными материалами использовались данные зоотехнического и племенного учета ООО «Дусым», то есть следующие документы: материалы годовых отчётов, материалы бонитировки, племенные свидетельства, документы первичного зоотехнического учёта (карточки коров и быков – форма 1-МОЛ, 2-МОЛ, а также акты контрольных доек).

Исследуемое поголовье крупного рогатого скота в течение проведения опыта находились в одинаковых условиях кормления и содержания, при этом были клинически здоровыми. Обслуживающий персонал (доярки, скотники и т.п.) в период проведения исследований был постоянным, что исключало влияние данного стрессового фактора на хозяйственно-полезные признаки животных.

Коров кормили по принятым в ООО «Дусым» рационам с учетом норм и рационов кормления сельскохозяйственных животных (А.П. Калашников и др., 2003). Рационы кормления подопытных коров-первотелок были сбалансированы по 23 основным показателям. Основными кормами в зимний период являлись: силос из кукурузы, сенаж из однолетних викоовсяных смесей, сено кострецовое, которые коровы получали в одинаковом количестве. Корнеклубнеплоды, зерновые концентраты и минерально-витаминные добавки вводили в рацион в зависимости от живой массы и фактического удоя коров. Кормление животных в летний период обеспечивалось за счёт зелёного корма на пастбище и в виде зелёной подкормки при содержании в стойлах. Кроме того, давали концентрированные корма, в расчёте 300-350 г на 1 кг молока.

Кровь, полученную из яремной вены животных, вносили в пробирки с 100 мМ ЭДТА до конечной концентрации 10 мМ.

Спермодозы от быков-производителей поступали в замороженном виде.



Выделение ДНК из крови проводили разработанным нами аммиачным и комбинированным щелочным способом.

Аммиачный способ. 100 мкл крови смешивали с 1000 мкл дистиллированной воды и центрифугировали при 10000 об/мин в течение 5 мин. Супернатант отбрасывали, а к осадку добавляли 100 мкл 10 % раствора аммиака «25-370С» и тщательно встряхивали смесь на вортексе при комнатной температуре до просветления суспензии. Полученный гомогенат выдерживали в термостате при 950С в течение 15 мин с открытой пробиркой.

Комбинированный щелочной способ. 100 мкл крови смешивали с 1 мл дистиллированной воды и центрифугировали при 10000 об/мин в течение 10 мин. Супернатант отбрасывали, а к осадку добавляли 50 мкл 0,2 М NaOH и тщательно встряхивали смесь на вортексе при комнатной температуре до просветления суспензии. Полученный гомогенат выдерживали в термостате при 600С в течение 10 мин. К лизату добавляли равный объем (50 мкл) 1М Трис-HCl (pH 8,0) и тщательно встряхивали смесь на вортексте при комнатной температуре. К полученному гомогенату добавляли 500 мкл 96% этанола и выдерживали полученную смесь при –200С в течение 30 мин. Нуклеопротеидный комплекс осаждали центрифугированием при 12000 об/мин в течение 10 мин. Супернатант отбрасывали, а осадок высушивали при 600С в течение 12 мин с открытой пробиркой. К высушенному осадку добавляли 100 мкл 10% аммиака, тщательно встряхивали смесь на вортексе при комнатной температуре и выдерживали в термостате при 600С в течение 10 мин, затем повторно встряхивали на вортексе и выдерживали в термостате при 600С в течение 10 мин. Полученный гомогенат выдерживали в термостате при 950С в течение 15 мин с открытой пробиркой.

Выделение ДНК из спермы проводили разработанным нами комбинированным щелочным способом.

Комбинированный щелочной способ. 50 мкл спермы растворяли в 500 мкл дистиллированной воды и осаждали при 10000 об/мин в течение 10 мин. К осадку добавляли 50 мкл лизирующего раствора (100 mM Tris-HCl (pH 8,0), 100 mM EDTA-Na (pH 8,0), 2% SDS, 1 mg/ml протеиназы K, 10 mM 2-меркаптоэтанола), тщательно суспендировали на вортексе и инкубировали при 550С в течение 1 часа, через каждые 15 мин встряхивая на вортексе. К лизату добавляли 50 мкл 0,5 М NaOH и тщательно встряхивали смесь на вортексе при комнатной температуре до просветления суспензии. Полученный гомогенат выдерживали в термостате при 550С в течение 30 мин, через каждые 15 мин встряхивая на вортексе. Добавляли равный объем (50 мкл) 1М Трис-HCl (pH 8,0) и тщательно встряхивали смесь на вортексте при комнатной температуре. Затем смешивали с 500 мкл 96% этанола осторожным покачиванием пробирки и выдерживали полученную смесь в морозильнике при –200С в течение 30 мин. Нуклеопротеидный комплекс осаждали центрифугированием при 13000 об/мин в течение 10 мин. Супернатант отбрасывали, а осадок высушивали при 600С в течение 10 мин с открытой пробиркой. К высушенному осадку добавляли 100 мкл 10% аммиака, тщательно встряхивали смесь на вортексе при комнатной температуре и выдерживали в термостате при 600С в течение 15 мин, затем повторно встряхивали на вортексе и повторяли процедуру термостатирования (600С, 15 мин). Полученный гомогенат инкубировали в термостате при 950С в течение 15 мин с открытой пробиркой. Препараты ДНК хранили в условиях морозильника. Перед использованием пробы ДНК размораживали в термостате при 370С в течение 15 мин.

Анализ локуса гена бета-лактоглобулина. ПЦР проводили на программируемом термоциклере «Терцик» (Россия) в объеме 20 мкл с праймерами BLGP3: 5/-GTCCTTGTGCTGGACACCGACTACA-3/ и BLGP4: 5/-CAGGACACCGG CTCCCGGTATATGA-3/, сконструированных Дж. Ф. Медрано и Е. Акилар-Кордова (J.F. Medrano and E. Aguilar-Cordova, 1990) для амплификации фрагмента гена бета-лактоглобулина длиной 262 bp.

Для определения полиморфизма гена бета-лактоглобулина по вариантам А и В 20 мкл ПЦР пробы обрабатывали 5 ед. эндонуклеазы рестрикции HaeIII в 1×буфере «С» фирмы СибЭнзим (Россия) при 37 0С течение ночи.

Для визуализации фрагментов ДНК пробы вносили в лунки 2,5 % агарозного геля с содержанием этидия бромида (0,5 мкг/мл) и проводили горизонтальный электрофорез при 15 В/см в течение 50 мин в 1×ТВЕ буфере.

Анализ локуса гена каппа-казеина. ПЦР проводили на программируемом термоциклере «Терцик» (Россия) в объеме 20 мкл, с серией отобранных праймеров:

1) Праймеры JК5: 5/-АТСАТТТАТGGCCATTCCACCAAAG-3/ и JКЗ: 5/-GC CCATTTCGCCTTCTCTGTAACAGA-3/, сконструированные Дж. Ф. Медрано и Е. Акилар-Кордова (J.F. Medrano and E. Aguilar-Cordova, 1990) для амплификации фрагмента гена каппа-казеина длиной 350 bp.

2) Праймеры AB1: 5/-TGTGCTGAGTAGGTATCCTAGTTATGG-3/ и АВ2: 5/-GCGTTGTCTTCTTTGATGTCTCCTTAG-3/, сконструированные А Барросо и др. (A. Barroso et al, 1998) для амплификации фрагмента гена каппа-казеина длиной 453 bp.

3) Праймеры К1: 5/-GAAATCCCTACCATCAATACC-3/ и К2: 5/-CCATCTA CGCTAGTTTAGATG-3/, сконструированные С. Камински (S. Kaminski, 1993) для амплификации фрагмента гена каппа-казеина длиной 271 bp.

4) Праймеры JK5-hs: 5/-GGGGGATCATTTATGGCCATTCCACCAAAG-3/ и JK3-hs: 5/-CCCCGCCCATTTCGCCTTCTCTGTAACAGA-3/, сконструированные Р.Р. Вафиным с соавт. (2007) для амплификации фрагмента гена каппа-казеина длиной 359 bp.

Для определения аллельного полиморфизма гена каппа-казеина 20 мкл ПЦР пробы обрабатывали 10 ед. эндонуклеазы рестрикции Hinf I в 1×буфере «О» фирмы СибЭнзим (Россия) или 10 ед. эндонуклеазы рестрикции HindIII в 1×буфере «W» фирмы СибЭнзим (Россия) при 37 0С течение ночи.

5) Праймеры B-F-hs: 5/-СССССGTGAGCCTACAAGTACACCTACCAT-3/, B-R-hs: 5/-СССССGATGTCTCCTTAGAGTATTTAGACC-3/, A-F-hs: 5/-GGGGGCT GTTCACACACAAAAACAGTAAAG-3/ и A-R-hs: 5/-GGGGGGTGCCTAACCTTA TACAGCCTTTCG-3/, сконструированные нами для амплификации фрагментов аллелей гена каппа-казеина длиной 242 bp (А) и 156 bp (В).

Для визуализации фрагментов ДНК пробы вносили в лунки 2,5 % агарозного геля с содержанием этидия бромида (0,5 мкг/мл) и проводили горизонтальный электрофорез при 15 В/см в течение 50 мин в 1×ТВЕ буфере.

Частоту встречаемости генотипов каппа-казеина и бета-лактоглобулина определяли по формуле:

р=n/N, где р – частота определения генотипа, n – количество особей,

имеющих определенный генотип, N – число особей.

Частоту отдельных аллелей определяли по формуле:



РА = (2nAA+nAB) : 2N и qB = (2nBB+nAB) : 2N, где PА – частота аллеля А,

qB – частота аллеля В, N – общее число аллелей.

По закону Харди-Вайнберга рассчитывали ожидаемые результаты частот генотипов в исследуемой популяции.

Молочную продуктивность определяли ежемесячно путём проведения контрольных доек (3 раза в месяц). На основании контрольных доек рассчитывали общую молочную продуктивность за 305 дней лактации, а также за укороченную лактацию, но не меньше 240 дней. Содержание жира в молоке определяли кислотным методом по Гербергу, а содержание белка – методом измерения массовой доли общего азота по Кьельдалю и определения массовой доли белка.

Определяли плотность молока с помощью ареометра (лактоденсиметра), сортность (класс) молока по редуктазной пробе с резазурином по цветовой шкале, сухое вещество в молоке – методом высушивания в сушильном шкафу до постоянной массы при температуре 1050С, содержание лактозы в молоке – на спектрофотометре (ГОСТ Р 51259-99).

Для определения сыропригодности молока использовали сычужную и сычужно-бродильную пробы (ГОСТ 9225-84).

Продолжительность свертывания молока определяли в минутах, учитывая время с момента внесения фермента до образования плотного сгустка.

Сыропригодность молока определяли по продолжительности его свертывания сычужным ферментом и делили на три типа:

I тип – молоко свертывается менее чем за 15 мин;

II тип – в течение 15-40 мин;

III тип – более чем за 40 мин, или же совсем не свертывается (Н.В. Барабанщиков, 1990).

Для изготовления сыра больше всего подходит молоко II типа и по нему отработаны технологические режимы производства. Молоко, медленно свертывающееся сычужным ферментом, считается несыропригодным.

Плотным считали сгусток без выделения сыворотки, пузырьков газа, трещин, пустот. При повороте пробирки на 180º сгусток не выпадал или выпадали лишь отдельные кусочки.

Рыхлым считали сгусток, имеющий немногочисленные глазки пузырьков газа, трещины. При повороте пробирки на 180º сгусток деформировался и выпадало до 50% от общего количества сгустка.

Дряблым считали сгусток, сильно пронизанный пузырьками газа, разорванный на куски, хлопьевидный. При повороте пробирки на 180º сгусток выпадал полностью или выпадало более 50% от общего количества сгустка.

Термоустойчивость молока определяли по тигловой пробе. В пробирки из молибденового стекла отмеряли по 2 мл молока. Затем пробирки с молоком ставили в ультратермостат и нагревали до температуры 135ºС, замечая время. Если в течение 5 мин консистенция молока не изменялась, то оно считалось термоустойчивым. Определяли также термостабильность, т.е. промежуток времени от момента помещения пробирок в ультратермостат до появления первых признаков коагуляции белков.

Статистическую обработку данных проводили с помощью программного обеспечения Microsoft Excel. Уровень достоверности полученных результатов определяли по критерию Стьюдента.
3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1. Оптимизация техники выделения ДНК из крови и спермы

ДНК из крови выделяли разработанным нами аммиачным и комбинированным щелочным способом.

Выделенные нами препараты ДНК из крови аммиачным и комбинированным щелочным способами показали эффективность своего применения в ПЦР для генотипирования крупного рогатого скота по генам каппа-казеина и бета-лактоглобулина.

Комбинированный щелочной способ выделения ядерной ДНК из лейкоцитов крупного рогатого скота позволяет сохранить экстрагированные нуклеиновые кислоты для ДНК-диагностики по генам бета-лактоглобулина и каппа-казеина в течение 1 года с более чем 30 кратной заморозкой-разморозкой.

Эффективность выделения ДНК из спермы быков-производителей была достигнута использованием в лизирующем растворе 2-меркаптоэтанола – сульфидредуцента, разрушающего дисульфидные связи, что в конечном счете позволяло протеиназе К и SDS довершить процедуру лизиса.

Заключительным этапом комбинированного щелочного способа экстракции ядерной ДНК из лейкоцитов и спермы крупного рогатого скота являлось применение 10% раствора аммиака, использованного в качестве растворителя осажденного нуклеопротеидного комплекса, предварительно экстрагированного NaOH. Выбранный подход растворения нуклеиновых кислот с последующим выпариванием аммиака позволял получать пригодные для молекулярно-генетических исследований препараты ДНК с долгосрочным периодом хранения.

Выделенные нами препараты ДНК из спермы быков-производителей оптимизированным комбинированным щелочным способом также показали эффективность своего применения в ПЦР для генотипирования крупного рогатого скота по генам бета-лактоглобулина и каппа-казеина.




Достарыңызбен бөлісу:
  1   2   3   4




©stom.tilimen.org 2022
әкімшілігінің қараңыз

    Басты бет