Эталонный метод для обнаружения коровьего молока и казеина в сырах, произведенных из овечьего, козьего, буйволиного молока или из смеси овечьего, козьего и буйволиного молока



Дата15.07.2017
өлшемі152.75 Kb.
#36495
Приложение № 8

к Методологии анализа и качественной

оценки молока и молочных продуктов

Эталонный метод для обнаружения коровьего молока и казеина в сырах, произведенных из овечьего, козьего, буйволиного молока или из смеси овечьего, козьего и буйволиного молока


  1. Данный метод описывает процедуру обнаружения коровьего молока и казеина в сырах, произведенных из овечьего, козьего, буйволиного молока или из смеси овечьего, козьего, буйволиного молока, путем изоэлектрической фокусировки γ-казеинов после плазмолиза.

  2. Данный метод используется для чувствительного и специфического обнаружения коровьего молока и казеина (с и без термической обработки) в свежем и зрелом сыре из овечьего, козьего или буйволиного молока или из смеси овечьего, козьего или буйволиного молока. Данный метод не может использоваться для обнаружения фальсификации молока и сыра с использованием прошедшего термическую обработку концентрата сывороточного протеина крупного рогатого скота.

  3. Принцип метода заключается в следующем:

  1. казеин изолируется из сыра и эталонных проб;

  2. изолированный казеин растворяется, после чего проводится расщепление плазмином;

  3. обработанные плазмином казеины в присутствии мочевины и при окрашивании протеинов подвергаются изоэлектрической фокусировке;

  4. Оценка осуществляется путем сравнения окрашенных γ2- и γ3-казеинов (подтверждение присутствия коровьего молока) между определяемыми пробами и эталонными пробами, вращающимися в том же геле и содержащими 0% и 1% коровьего молока.

  1. За неимением других указаний, необходимо использовать для анализа чистые реактивы. Воду необходимо дистиллировать два раза или следует взять воду соответствующей чистоты.

Следующие данные действительны для полиакриамидных гелей с содержанием мочевины, полученных в лаборатории, в формате 265 × 125 × 0,25 мм. В случае использования других рецептур или форматов гелей, возможно, понадобится откорректировать условия отделения.

Изоэлектрическая фокусировка



  1. Реактивы для получения полиакриамидных гелей с содержанием мочевины

  1. Исходный гель-раствор

Растворяются в воде:

4,85 г акриламида;

0,15 г N, N'-метилен-бис-акриламида (BIS);

48,05 г мочевины;

15,00 г глицерина (87 % м/м);

после этого раствор доводится до количества 100 мл и переливается в бутылки из коричневого стекла и хранится в холодильнике.

Вместо указанного содержания твердых компонентов нейротоксичных акриламидов можно использовать доступные в продаже готовые растворы акриламида. В случае использования подобного раствора с содержанием 30% (м/м) акриламида и 0,8% (м/м) BIS вместо твердых компонентов следуют использовать 16,2 мл раствора. Срок годности исходного гель-раствора составляет не более 10 дней; если проводимость составляет более 5 мкс, в раствор добавляются 2 г Amberlite MB-3, после чего раствор деионизируется при помешивании в течение 30 минут и затем фильтруется на мембранном фильтре 0,45 мкм.


  1. Гель-раствор

Из исходного гель-раствора путем добавления различных амфолитов и добавок приготовляется гель-раствор:

9,0 мл исходного гель-раствора;

24 мг β-аланина;

500 мкл амфолита pH 3,5-9,5;

250 мкл амфолита pH 5-7;

250 мкл амфолита pH 6-8. 

Гель-раствор перемешивается в течение 2-3 минут и подвергается сухой перегонке в ультразвуковой ванне или в вакууме.

Гель-раствор смешивается непосредственно перед наливанием (подпункт 2) пункта 6).



  1. Растворы катализаторов

N, N, N' N' – тетраметилэтилендиамин (Temed)

40 % м/м персульфата аммония (PER):

800 мг PER растворяются в воде, и раствор дополняется до получения количества 2 мл.

Следует использовать всегда свежеприготовленный раствор PER.



  1. Контактная жидкость – керосин или н-декан

  2. Анодный раствор

В воде растворяются 5,77 г фосфорной кислоты (85 % м/м), после чего раствор дополняется водой до получения количества 100 мл.

  1. Катодный раствор

В воде растворяются 2,00 г гидроксида натрия, после чего раствор дополняется водой до получения количества 100 мл.

Приготовление пробы



  1. Реактивы для протеиновой изоляции

  1. разбавленная уксусная кислота (к 25,0 мл уксусной кислоты добавляется вода до получения количества 100 мл);

  2. дихлорметан;

  3. ацетон;

  1. белковый буферный раствор.

В дистиллированной воде растворяются:

5,75 г глицерина (87 % м/м);

24,03 г мочевина;

250 мг дитиотреитола;

после чего раствор дополняется до получения количества 50 мл.

Раствор следует хранить в холодильнике в течение не более одной недели.



  1. Реактивы для расщепления казеинов плазмином

  1. Буферный раствор карбоната аммония:

0,2 моль/л раствора NH4HCO3 (1.58 г/100 мл воды), в который было добавлено 0,05 моль/л этилендиаминтетрауксусной кислоты (EDTA, 1,46 г/100 мл), титруется с 0,2 моль/л раствора карбоната аммония (1,92 г/100 мл воды), в который было добавлено 0,05 моль/л EDTA, до получения pH 8;

  1. плазмин бычий с минимальной активностью 5 U/мл;

  2. ε-аминокапроновая кислота для активации ферментов

2,624 г ε-аминокапроновой кислоты (6-амино-н-гексановая кислота) растворяются в 100 мл этанола 40 % (v/v).

  1. Эталонные пробы:

  1. смеси створоженного овечьего и козьего молока с содержанием 0% и соответственно 1% коровьего молока;

  2. приготовление временных эталонных проб в условии лаборатории из створоженного буйволиного молока с содержанием 0% и соответственно 1% коровьего молока.

Обезжиренное молоко приготавливается путем сепарирования сырого буйволиного молока или сборного коровьего молока при температуре 37°C (2500 г в течение 20 минут). После быстрого охлаждения емкости центрифуги вместе с содержимым до 6-8°C полностью удаляется верхний слой жира. Для приготовления 1% эталонного раствора 495 мл обезжиренного буйволиного молока добавляются в литровую стеклянную емкость вместе с 5,00 мл обезжиренного коровьего молока, после чего путем добавления разбавленной молочной кислоты (10% m/v) раствор доводится до получения pH 6,4. Температура устанавливается на 35°C, после чего добавляются 100 мкл телячьего сычуга, все перемешивается в течение одной минуты, а затем стеклянная емкость накрывается алюминиевой фольгой и настаивается в течение 1 часа при температуре 35°C, для образования творога. После этого заквашенная проба молока, без предварительного перемешивания или сливания сыворотки, лиофилизуется. После лиофилизации продукт измельчается до получения равномерной и однородной смеси. Для приготовления 0% эталонного раствора используется тот же метод с обезжиренным буйволиным молоком. Эталонные растворы следует хранить при температуре -20°C.

Перед приготовлением эталонных проб, рекомендуется проверить чистоту буйволиного молока путем изоэлектрической фокусировки обработанных плазмином казеинов.

Реактивы для окрашивания белка


  1. Фиксирующий раствор

В воде растворяются 150 г трихлоруксусной кислоты, после чего раствор дополняется до получения количества 1000 мл.

  1. Раствор для обесцвечивания

В дистиллированной воде растворяются до 500 мл метанола и 200 мл ледяной уксусной кислоты.

Ежедневно приготаввливается свежий обесцвечивающий раствор. Он может приготавливаться из питающих растворов 50% (v/v) метанола и 20% (v/v) ледяной уксусной кислоты путем перемешивания равных частей.



  1. Растворы для окрашивания

  1. Растворы для окрашивания (питающий раствор 1)

3,0 г кумасси бриллиантового голубого G-250 растворяются в 1 000 мл метанола 90 % (v/v), перемешиваются при помощи магнитной мешалки (в течение примерно 45 минут), после чего фильтруются через два плиссированных фильтра на средней скорости.

  1. Раствор для окрашивания (питающий раствор 2)

5,0 г сульфата пентагидрата меди растворяются в 1000 мл 20% уксусной кислоты (v/v).

  1. Раствор для окрашивания (готовый к использованию раствор)

Непосредственно перед окрашиванием перемешиваются по 125 мл каждого питающего раствора.

Рекомендуется готовить раствор для окрашивания в день его использования.



  1. Лабораторное оборудование:

  1. стеклянные пластинки (265 × 125 × 4 мм); резиновый ролик (ширина вала 15 см); регулируемый стол;

  2. пленочный носитель для геля (265 × 125 мм);

  3. контрпленка (280 × 125 мм). Обе продольные стороны приклеиваются при помощи клеящей ленты (280 × 6 ×0,25 мм) (рисунок 1).




Рисунок 1. Изображение контрпленки


  1. камера для электрической фокусировки с охлаждающей плитой с подходящим аккумулятором (≥ 2,5 кВ) или автомат для электрофореза;

  2. ротационный криостат, регулируемый термостатом до температуры 12 ± 0,5 °C;

  3. центрифуга, регулируемая до 3 000 г;

  4. электродные полосы (длиной ≥ 265 мм);

  5. капельные склянки из пластика для анодного и катодного раствора;

  6. пробные аппликаторы (10 × 5 мм, вискоза или фильтровальная бумага с минимальным поглощением протеина);

  7. ножницы, скальпель и пинцеты из высококачественной стали;

  8. емкости из высококачественной стали для окрашивания и обесцвечивания;

  9. регулируемый гомогенизирующий стержень (диаметр стержня 10 мм), диапазон частоты вращения 8 000 – 20 000 мин-1;

  10. магнитная мешалка;

  11. ультразвуковая ванна;

  12. аппарат для сварки пленок;

  13. микропипетка 25 мкл;

  14. вакуумная центрифуга или сублимационная сушка;

  15. водяная баня, регулируемая термостатом до температуры 35 и 40 ± 1 °C;

  16. денситометр регистрации при λ = 634 nm.

  1. Процедура обнаружения коровьего молока и казеина в сырах, произведенных из овечьего, козьего, буйволиного молока или из смеси овечьего, козьего, буйволиного молока, осуществляется следующим образом:

  1. приготовление пробы;

  1. изолирование казеина

В центрифужную трубку емкостью 100 мл добавляется количество сыра или эталонной пробы, эквивалентное 5 г сухой массы. Затем добавляются 60 мл дистиллированной воды. После этого проба перемешивается при помощи гомогенизатора до получения однородной массы (8 000-10 000 об/мин). Путем добавления разбавленной уксусной кислоты уровень рН регулируется до 4,6, после этого пробы центрифугируются (в течение 5 минут, 3000 г). Жиры и сыворотка сцеживаются, а остаток гомогенизируется (20 000 об/мин) в 40 мл дистиллированной воды, уровень рН в которой был отрегулирован путем добавления разбавленной уксусной кислоты до 4,5. После этого в раствор добавляются 20 мл дихлорметана, вся смесь гомогенизируется еще раз, а затем центрифугируется (в течение 5 минут при 3000 г). Слой казеина, плавающий между водянистой и органической фазами (рисунок 2), приподнимается при помощи лопаточки для того, чтобы можно было сцедить обе фазы. Казеин гомогенизируется еще раз в 40 мл дистиллированной воды и гомогенизируется вместе с 20 мл дихлорметана, а затем центрифугируется. Данная процедура повторяется до тех пор, пока обе экстракционные фазы не станут бесцветными (от двух до трех раз). Белковый остаток гомогенизируется вместе с 50 мл ацетона и фильтруется через плиссированный бумажный фильтр на средней скорости. Остающаяся на фильтре фракция промывается два раза, каждый раз 25 мл ацетона, высушивается на воздухе или потоком азота, после чего превращается в мелкий порошок в ступке.



Рисунок 2. Слой казеина, плавающий между водянистой и органической фазами

Сухие казеиновые изоляты следует хранить при температуре –20 °C.



  1. Расщепление плазмином ß-казеинов для увеличения концентрации γ- казеинов.

Приготавливается суспензия из 25 мг казеинового изолята (подпункт 1 настоящего пункта) в 0,5 мл буферного раствора карбоната аммония, которая затем гомогенизируется в течение 20 минут, например, в ультразвуковой ванне. Гомогенизированная суспензия нагревается до температуры 40°C, смешивается с 10 мкл плазмина, перемешивается, после чего в нее добавляются 200 мг твердой мочевины и затем 2 мг дитиотреитола.

Для улучшения симметрии фокусированных полос казеина рекомендуется лиофилизировать раствор после добавления ε-аминокапроновой кислоты, растворив остаток пробы в 0,5 мл буферного раствора мочевины.



  1. Приготовление полиакриламидных гелей с содержанием мочевины

При помощи нескольких капель воды на стеклянную пластинку натягивается пленка для геля, при этом излишки воды удаляются при помощи бумажной салфетки. Таким же образом на другую стеклянную пластинку, прикрепленную на распорных держателях, натягивается контрпленка (0,25 мм). Пластинка устанавливается горизонтально на регулируем столе.

Приготовленный свежий дегазированный гель-раствор соединяется с 10 мкл раствора катализатора Temed и 10 мкл раствора PER, хорошо перемешивается и выливается равномерно по центру контрпленки. Несущая пластинка для геля (пленкой вниз) устанавливается на край регулируемой пластинки с контрпленкой и опускается медленно до тех пор, пока между пленками не образуется тонкая гелевая пленка, распространяющаяся равномерно и без образования пузырей (рисунок 3). Пластинка с несущей пленкой для геля полностью опускается при помощи тонкой лопатки, три другие стеклянные пластинки используются в качестве прижимного веса. После завершения полимеризации (примерно 60 минут), путем наклона стеклянных пластинок, полимирезованный гель на несущей пластинке для геля снимается вместе с контрфольгой. Обратная сторона несущей фольги с гелем тщательно очищается от остатков геля и мочевины. «Гелевый сэндвич» сваривается по краям в шланг из фольги и хранится в холодильнике (не более 6 недель).



Рисунок 3. Техника складывания для получения очень тонких слоев полиакриламидного геля

a – клеящая лента для разбивки (0,25 мм);

b – покрывающая фольга;

c, e – стеклянные пластинки;

d – гель-раствор;

f – несущая фольга для геля.

Покрывающая фольга с распорными держателями может использоваться повторно. Полиакриламидный гель можно разрезать на куски равного размера, что рекомендуется в случае небольшого объема пробы или в случае использования автомата для электрофореза (два куска геля размером 4,5х5 см).



  1. Изоэлектрическая фокусировка

Охлаждающий термостат устанавливается на температуру 12°C. Обратная сторона несущей фольги для геля протирается керосином, после чего несколько капель керосина наносятся по центру охлаждающегося блока. «Гелевый сэндвич», несущей фольгой вниз, раскатывается без образования пузырей. Выступающий керосин вытирается, и покрывающая фольга снимается. Электродные полоски пропитываются соответствующими растворами для электродов, разрезаются по длине геля и выкладываются на предусмотренных для этого местах (расстояние между электродами 9,5 см).

Условия проведения изоэлектрической фокусировки:

Размер куска геля 265 × 125 × 0,25 мм


Этап

Время

(мин)

Напряжение

(В)

Сила тока

(мA)

Мощность

(Вт)

Вольт-часы

(В/ч)

1.  Предварительная фокусировка

30

максимум 2 500

максимум 15

константно 4

примерно 300

2.  Фокусировка пробы (1)

60

максимум 2 500

максимум 15

константно 4

примерно 1 000

3.  Завершающая фокусировка

60

максимум 2 500

максимум 5

максимум 20

примерно 3 000

40

максимум 2 500

максимум 6

максимум 20

примерно 3 000

30

максимум 2 500

максимум 7

максимум 25

примерно 3 000

(1)   Нанесение пробы: После предварительной фокусировки (этап 1) 18 мкл пробы и эталонные растворы наносятся пипеткой на аппликаторы для проб (10х5 мм) и наносятся на расстоянии 1 мм друг от друга, а также на расстоянии 5 мм в продольном направлении от анода на гель, слегка придавливаясь. Процедура фокусировки проводится с соблюдением описанных выше условий. После 60-минутной фокусировки пробы необходимо осторожно снять аппликаторы для пробы.

В случае изменения толщины или ширины кусков геля следует отрегулировать соответствующим образом силу тока и мощность.



  1. Окрашивание белка

  1. Фиксирование белков

После прекращения подачи электрического тока электродные полосы снимаются. Гель помещается сразу же в емкость для окрашивания/обесцвечивания, наполненную 200 мл фиксирующего раствора, где он непрерывно встряхивается в течение 15 минут.

  1. Промывка и окрашивание пластинки с гелем

Фиксирующий раствор полностью сливается, и пластинка с гелем промывается два раза по 30 секунд в 100 мл обесцвечивающего раствора. Обесцвечивающий раствор сливается, и миска наполняется 250 мл раствора для окрашивания. В течение 45 минут следует слегка поворачивать раствор для окрашивания, с тем чтобы он оказывал свое действие.

  1. Обесцвечивание пластинки с гелем

Раствор для окрашивания сливается, пластинка с гелем промывается дважды в 100 мл обесцвечивающего раствора и затем не менее двух-трех раз по 15 минут помещается в 200 мл обесцвечивающего раствора, пока основание не станет прозрачным и бесцветным. Пластинка с гелем промывается, затем в дистиллированной воде (два раза по 2 минуты) и высушивается на воздухе (от 2 до 3 часов) или при помощи фена (примерно 10-15 минут).

Фиксация, промывание, окрашивание и обесцвечивание осуществляются при температуре 20°C. Данные процедуры нельзя проводить при более высокой температуре.

В случае если отдается предпочтение более чувствительному окрашивающему раствору с содержанием серебра, казеиновые пробы, обработанные плазмином, следует разбавить до 5 мг/мл.


  1. Оценка осуществляется путем сравнения образцов белковых полос неизвестной пробы с эталонными пробами, на одном и том же геле. Обнаружение коровьего молока в овечьем, козьем или буйволином сыре и в смесях из овечьего, козьего или буйволиного сыра осуществляется при помощи γ3- и γ2-казеинов, в случае которых изоэлектрические точки находятся в диапазоне рН 6,5 рН 7,5 (рисунки 4а, 4b и 5). Предел обнаружения данным методом составляет менее 0,5%.


Рисунок 4a. Изоэлектрическая фокусировка казеинов, обработанных плазмином, в овечьем и козьем молоке, содержащем различные количества коровьего молока
% CM = содержание коровьего молока в процентах;

C = корова;

E = овца;

G = коза.

На рисунке изображена верхняя половина геля IEF.


Рисунок 4b. Изоэлектрическая фокусировка казеинов, обработанных плазмином, в смесях из овечьего, козьего и буйволиного молока, содержащего различные количества коровьего молока.
% CM = содержание коровьего молока в процентах;

1 + = проба, содержащая 1 % коровьего молока, соединенная с чистым казеином из коровьего молока по центру протока геля.

C = корова;

E = овца;

G = коза;

B = буйволица.

На рисунке представлено общее разделительное расстояние геля IEF.


Рисунок 5. Серия денситограмм эталонных проб (STD) и проб сыра, приготовленного из смеси овечьего и козьего молока, после изоэлектрической фокусировки
a, b – эталонная проба, содержащая 0, соответственно 1 % коровьего молока;

c-g – проба сыра, содержащая 0, 1, 2, 3 и 7 % коровьего молока.

C - корова;

E - овца;

G - коза.

Верхняя половина геля IEF была проанализирована при λ = 634 нм.



  1. Визуальное определение

Для визуального определения содержания коровьего молока рекомендуется отрегулировать концентрацию проб и эталонных проб в зависимости от насыщенности овечьих, козьих и/или буйволиных γ2- и γ3-казеинов (смотри „γ2 E, G, B” и „γ3 E, G, B” на рисунках 4 a и 4 b и на рисунке 5). Только в данном случае содержание коровьего молока (менее, равное или более 1%) можем быть определено в изучаемой пробе путем прямого сравнения насыщенности γ2- и γ3-казеинов из коровьего молока (смотри „γ3 C” и „γ2 C” на рисунках 4 a, 4 b и 5) с эталонными пробами с 0% или 1% содержанием (овца, коза) или полученными в лаборатории временными эталонными пробами (буйволиное молоко).

  1. Денситометрическое определение

По возможности, при помощи денситометра определяется соотношение площадей пиков γ2- и γ3-казеинов (рисунок 5) между коровьим и овечьим, козьим и/или буйволиным молоком. Данная велечина сравнивается с соотношением площадей пиков γ2- и γ3-казеинов в 1 % эталонной пробе (овца, коза) или во временной полученной в лаборатории эталонной пробе (буйволица), находящейся в том же геле.

Данный метод предоставляет надежные результаты, если эталонная проба, содержащая 1% коровьего молока, реагирует однозначно положительно как на γ2-, так и на γ3-казеины, а 0% эталонная проба не реагирует. В остальных случаях метод следует оптимизировать, соблюдая в точности предписание по проведению метода.



Выборочная проба считается положительной, если оба казеина коровьего молока γ2 и γ3 или соответствующие соотношения площадей пиков являются большими или равными уровню 1% эталонной пробы.


Достарыңызбен бөлісу:




©stom.tilimen.org 2022
әкімшілігінің қараңыз

    Басты бет