Дисбаланс цитокинов при синдроме диабетической стопы и подходы к его коррекции 14. 03. 09 клиническая иммунология, аллергология 14. 01. 02 эндокринология

БАКОТИНА АННА ЕВГЕНЬЕВНА

ДИСБАЛАНС ЦИТОКИНОВ ПРИ СИНДРОМЕ ДИАБЕТИЧЕСКОЙ СТОПЫ И ПОДХОДЫ К ЕГО КОРРЕКЦИИ

14.03.09 – клиническая иммунология, аллергология

диссертации на соискание ученой степени

кандидата медицинских наук

Москва – 2010

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Российский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

доктор медицинских наук,

профессор Ковальчук Леонид Васильевич

кандидат медицинских наук,

профессор Потемкин Владимир Васильевич

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук,

профессор Черноусов Александр Дмитриевич

доктор медицинских наук,

профессор Петунина Нина Александровна

Ведущая организация: ГОУ ВПО Московский медико-стоматологический университет Росздрава

Защита диссертации состоится «20» сентября 2010 года в 14.00 часов на заседании диссертационного совета Д 208.072.05 при ГОУ ВПО РГМУ Росздрава по адресу: 117997, г. Москва, ул. Островитянова, д.1

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО РГМУ Росздрава по адресу: 117997, г. Москва, ул. Островитянова, д.1

Автореферат разослан «30» июня 2010 года.

Ученый секретарь диссертационного совета

кандидат медицинских наук, доцент Кузнецова Т.Е.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

По данным Всемирной Организации Здравоохранения в настоящее время в мире насчитывается около 180 миллионов больных сахарным диабетом (СД). Расчеты показали, что, в случае увеличения средней продолжительности жизни до 80 лет, количество больных СД может достигнуть 17% от численности всего населения. В развитых промышленных странах заболеваемость СД колеблется от 1% до 6% от общего количества населения, а среди лиц старше 65 лет около 10%. Россия входит в пятерку стран с наибольшей заболеваемостью СД. Учитывая хроническое неизлечимое течение заболевания и увеличивающуюся среднюю продолжительность жизни пациентов, все большую актуальность приобретают исследования, направленные на разработку методов диагностики, профилактики и лечения поздних осложнений СД. Одним из осложнений СД, наиболее часто приводящим к инвалидизации и снижению качества жизни пациентов, является синдром диабетической стопы (СДС) [Дедов И.И. и соавт. 2005].

Синдром диабетической стопы наблюдается у 10-30% больных СД. Ампутации нижних конечностей у данной группы пациентов производятся в 20-40 раз чаще, чем у остального населения. Число больших ампутаций при гнойно-некротических осложнениях диабетической стопы снижается медленно и составляет 30 - 35% из всех больных СД. Прогноз еще более удручает, если учесть, что почти у каждого второго больного после ампутации через 3-4 года приходится ампутировать и другую конечность. 85% высоких ампутаций при СДС возможно было бы предотвратить [Токмакова А.Ю. и соавт. 2003; Lobmann R. Et al., 2002].

В последние годы появились новые данные о патогенезе диабетической микро- и макроангиопатии, нейропатии [Токмакова А.Ю. и соавт. 2003]. Если традиционно считали пусковым механизмом и основным фактором данных процессов нарушения углеводного обмена, то с современных позиций, в патогенезе СДС существенную роль стали отводить иммунным механизмам. По немногочисленным данным, для СДС характерны разноплановые по точкам приложения и глубине изменения в иммунной системе – снижение количества и функциональной активности Т-лимфоцитов, нарушение фагоцитарного звена, дисиммуноглобулинемия, а также дисбаланс цитокинов [Amery CM. et al., 2005; Efton P.A. et al., 2004]: повышение провоспалительных и снижение противовоспалительных цитокинов. Цитокины, являясь универсальными регуляторами клеточных функций, секретируются всеми типами клеток: лимфоцитами, моноцитами, макрофагами, нейтрофилами, клетками эпителия, эндотелия, фибробластами, их высокоспецифические рецепторы на связывающих клетках образуют единую клеточно-медиаторную цепь, участвующую в развитии иммунного ответа, а также процессов воспаления и регенерации, однако, практически не изучено содержание цитокинов в отделяемом раны при синдроме диабетической стопы.

Развитие методов иммунодиагностики и появление новых иммуномодуляторов позволяет на сегодняшний день не только выявить уровень дефекта в иммунной системе, но и провести направленную иммунокоррекцию.

Большой интерес в последние годы вызывает использование цитокинов и различных факторов роста в лечении хронических ран у больных СД. Факторы роста регулируют синтез коллагена и компонентов соединительнотканного матрикса, рост сосудов и реэпителизацию.

Все вышеизложенное обосновывает актуальность проблемы и целесообразность выполнения исследования с целью изучения возможности применения цитокинов и факторов роста у больных с СДС.

Цель исследования: оптимизация лечебной тактики больных с синдромом диабетической стопы путем локальной цитокинотерапии на основе коррекции цитокинового дисбаланса.

Задачи исследования:

1. Провести исследование уровней про- и противовоспалительных цитокинов (ИЛ-8 и ТФР-β) в сыворотке крови и экссудате раневого отделяемого больных с синдромом диабетической стопы. Изучить взаимосвязь уровней данных цитокинов с длительность сахарного диабета, уровнем гликированного гемоглобина (HbA1c).

2. Оценить влияние выявленных нарушений цитокинового статуса на течение и исход различных форм диабетической стопы.

3. Сравнить эффективность лечения больных с синдромом диабетической стопы при использовании традиционной терапии и комплексной терапии с применением природного комплекса цитокинов (Суперлимфа).

4. Исследовать влияние локальной цитокинотерапии на заживление язвенных дефектов у больных с синдромом диабетической стопы.

Научная новизна исследования.

Впервые исследован системный и локальный цитокиновый статус у больных с разными формами диабетической стопы и показана более высокая клиническая значимость показателей цитокинов в экссудате раневого отделяемого.

Впервые определены уровни про- и противовоспалительных цитокинов в экссудате раневого отделяемого из трофических язв больных с синдромом диабетической стопы и выявлен дисбаланс с преобладанием провоспалительного цитокина.

Впервые показана эффективность применения иммунотропного препарата Суперлимф в комплексном лечении больных с синдромом диабетической стопы, коррелирующая с повышением концентрации ТФР-β и снижением концентрации ИЛ-8 в раневом отделяемом.

Выявленные нарушения цитокинового дисбаланса (повышение провоспалительных и снижение противовоспалительных цитокинов) у больных с различными формами синдрома диабетической стопы обосновывают необходимость применения методов иммунокоррекции в комплексной терапии при СДС.

Получено улучшение результатов лечения больных с трофическими язвами стоп при СД 2 типа с помощью иммунотропного препарата Суперлимф. У больных, леченных Суперлимфом наблюдалась положительная динамика субъективной симптоматики, быстрое купирование признаков эндогенной интоксикации, быстрая компенсация СД, наиболее полная эрадикацией микроорганизмов из очага воспаления, интенсивная положительная динамика раневого процесса и нормализация баланса про- и противовоспалительных цитокинов.

Положения, выносимые на защиту.

1.Изменение локального цитокинового статуса в виде снижения противоспалительных и повышения провоспалительных цитокинов характерно для больных с СДС.

2.Уровни цитокинов экссудата раневого отделяемого зависят от длительности СД, уровня НвА1с, ЛИИ и не зависят от формы СДС.

3.Применение Суперлимфа в комплексной терапии больных с СДС способствует нормализации иммунного статуса, что в свою очередь обеспечивает эффективное заживление язвенных дефектов стоп при СДС.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

В настоящее исследование были включены 72 больных сахарным диабетом 2 типа с СДС, составившие две группы: исследуемую группу и группу сравнения. В исследуемую группу (группа 1) включены 38 пациентов, у которых наряду со стандартным лечением СДС, проводились местные аппликации с раствором иммуномодулятора Суперлимф по общепринятой схеме. Группу сравнения (группа 2) составили 34 больных, у которых применялась традиционное для данной патологии лечение.

Из 72 пациентов, включенных в исследование, женщин было - 43 (63,5%), мужчин - 29 (36,5 %). Возраст пациентов колебался от 52 до 78 лет, средний возраст пациентов группы 1 66±7,9 лет, группы 2 - 65,4±6,6 лет. Длительность СД 2 типа у пациентов 1 группы составила в среднем 11,5±6,2 года, группы 2 – 12±6,3 лет. У всех пациентов проводилась до госпитализации медикаментозная терапия СД: инсулинотерапию получал 31 больной (43%), пероральные сахароснижающие препараты (ПССП)- 17 человек (23,6%), комбинированную терапию – 24 человека (33,4%). Средний уровень гликированного гемоглобина в исследуемой группе составил 10,5±1,4 %, в группе сравнения – 10,5±1,2 %.

Из сопутствующих заболеваний преобладали ИБС у 63 (87,5%), гипертоническая болезнь у 55 (76,5%) человек, хронический пиелонефрит у 43 (60%). У 54 (75%) пациентов выявлено наличие ожирения 1-3 степени. ИМТ у пациентов 1 группы составил 32,5±4,4, у 2 группы – 32,7±5 (р>0,05). Выявлены также другие осложнения СД: диабетическая ретинопатия у 29 (40,3%), диабетическая нефропатия у 26 (36%).

Учитывая специфику стационара и в соответствии с целями и задачами нашего исследования, в исследование были включены больные с нейропатической и нейро-ишемической формами СДС и с 3 степенью поражения стоп по Вагнеру.

Критериями исключения из исследования были пациенты с другими формами и стадиями диабетической стопы, тяжелые сопутствующие заболевания (острая недостаточность кровообращения, деменция, онкология, инфаркт миокарда), необходимость экстренного хирургического лечения.

В исследуемой группе у 25 (34,7 %) пациентов диагностирована нейро-ишемической форма и у 13 (18,1 %) – нейропатическая форма СДС, в группе сравнения у 23 (30,6 %) - нейро-ишемическая формой, у 11 (16,6%) – нейропатическая форма.

Длительность персистирования СДС составила 18,4±12 месяцев у пациентов 1 группы и 21±10,5 месяцев во второй группе (р>0,05). Наличие язвенного дефекта впервые диагностировано в сроки от 2 до 20 месяцев после появления симптомов СДС у пациентов 1 группы, от 1 до 21 месяцев – у больных в группе сравнения.

Площадь язвенного дефекта у пациентов 1 группы составляла в среднем 2,7±1,9 см², а в группе 2 – 2,9±1,4 см², глубина язвенного дефекта в 1 группе составила в среднем 2,9±1,8 мм, во 2 – 3,1±1,4 мм.

Клиническая характеристика обследованных больных представлена в таблице 1.

Табл.1. Клиническая характеристика обследованных больных.

Показатель	1группа (n=38) топическая иммунотерапия	2 группа(n=34) традиционное лечение
Пол, (м/ж) (n)	16 (22%) 22 (31%)	13 (18%) 21 (29%)
Возраст, (годы)	66±7,9	65,2±7,3
Длительность СД (годы)	11,5±6,2	12±6,3
Глюкоза крови натощак/глюкоза крови после еды (ммоль/л)	11,1±1,6 13,5±1,9	11,3±2 13,2±2,3
НВА1С (%)	10,5±1,4	10,8±1,2
ОХс, ммоль/л ТГ, ммоль/л	5,95±1,3 2,3±1,1	5,7±1,2 2,02±0,7
Нейропатическая форма (n)	13 (18,1%)	11 (16,6%)
Нейро-ишемическая форма (n)	25 (34,7%)	23 (30,6%)
Длительность СДС (мес.)	18,2±12	21±11,1

- Стандартный опрос с учетом анамнеза жалоб, анамнестических данных.

- Физикальное обследование. ИМТ рассчитывали как величину отношения массы тела в килограммах к квадрату роста в метрах (за норму считали ИМТ до 25 кг/м2)

При осмотре нижних конечностей обращали внимание на цвет кожных покровов, наличие отеков, температуру кожных покровов, наличие гиперкератоза и деформаций. При поступлении и в динамике измеряли площадь и глубину язвенного дефекта, фиксировали наличие локальных признаков инфицирования.

-Уровень глюкозы в капиллярной крови определяли с помощью стандартных тест-полосок на глюкометре «Glucotrend» (Boehringer Mannheim Roche) (Австрия)

- Уровень гликированного гемоглобина определяли на приборе DCA 2000-методом латексного ингибирования иммуноагглютинации с помощью «Hemoglobin A1c Reagent kit.

- Токсичность крови изучали при помощи вычисления лейкоцитарного индекса интоксикации (ЛИИ), который рассчитывается по Я. Я. Кальф-Камфу и С.Н. Захарову и соавт. (1982):

ЛИИ= (4 Ми + 3 Ю + 2 П + С) × (Пл + 1)

______________________________

(Мон + Лимф) × (Э + 1)

Ми – миелоциты, Ю – юные формы, П – палочкоядерные, С – сегментоядерные нейтрофилы, Пл – плазматические клетки, Мон – моноциты, Лимф – лимфоциты, Э – эозинофилы. В норме ЛИИ=1,3±0,5.

Всем больным, проводили иммунологическое исследование уровня про- и противовоспалительных цитокинов (ИЛ-8 и ТФР-β) в сыворотке крови и экссудате раневого отделяемого язвенного дефекта до и после лечения. Забор материала из гнойно-некротического очага производили фильтровальной бумагой 1,0*1,0 см., которую затем помещали в пробирку Эппендорфа объемом 1,5 мл в 100 мкл стерильного физиологического раствора, через 30 минут фильтровальную бумагу изымали и содержимое пробирки замораживали для дальнейшего хранения в течение месяца.

Определение уровня цитокинов осуществляли методом иммуноферментного анализа (ИФА) с использованием тест-систем, выпускаемых фирмой BIOSOURCE (Бельгия). Тест-системы представляют собой микропланшеты, покрытые антителами к антигену - исследуемой структуре цитокина, в нашем случае к ИЛ-8 и ТФР-β.

Всем пациентам проводили бактериологическое исследование локальной микрофлоры язвенного дефекта и ее чувствительность к антибиотикам с определением количественного содержания в 1 г тканей.

Для диагностики периферической сенсомоторной нейропатии проводили общепринятое комплексное неврологическое клинико-инструментальное обследование, включающее оценку шкалы неврологических симптомов - NSS (Neuropathy Symptom Score или нейропатический симптоматический счет) и шкалы признаков – NDS (Neuropathy Disability Score или нейропатический дисфункциональный счет) (Young M.J., 1993, Dyck P.J., 1992).

Cтепень тяжести периферической сенсомоторной нейропатии оценивали на основании исследования порогов 4 видов чувствительности (тактильной, болевой, температурной и вибрационной) и исследования рефлексов (ахилловых и коленных) на основании стандартизированных тестов, принятых в международной практике для исследования периферической сенсомоторной нейропатии.

Порог вибрационной чувствительности исследовали при помощи градуированного неврологического камертона, вибрирующего с частотой 128 Гц. Вибрационная чувствительность определялась на верхушке I пальца стопы и на медиальной лодыжке. Оценка температурной чувствительности проводилась с помощью устройства Тип-темп (Tip-term). Для определения тактильной чувствительности применяли стандартный монофиламент для обследования нижних конечностей, создающий на коже давление в 10 г. Для исследования болевой чувствительности использовалась «английская» булавка, для распознавания пациентом прикосновения острого и тупого предмета.

Для исследования ахилловых и коленных рефлексов использовался неврологический молоточек, с оценкой их, как нормальные, ослабленные, отсутствующие.

Ультразвуковая допплерография (УЗДГ) проводилась на аппарате HITACHI фирмы EUB. Степень нарушения гемодинамики сохранившейся конечности определялась по величине плече-лодыжечного индекса (ПЛИ). ПЛИ вычисляли как отношение величины систолического давления в артерии нижней конечности к величине систолического давления в плечевой артерии.

Всем больным проводилась рентгенографическое исследование стоп и голеностопных суставов в двух проекциях.

Всем пациентам проводилась инсулинотерапия под контролем показателей гликемии, антибактериальная терапия.

У пациентов, имеющих язвенные дефекты с грубыми гиперкератозными краями, проводилось очищение раны механическим путем при помощи скальпеля, затем язвенный дефект промывали жидким антисептиком (0,5% раствором диоксидина, 0,01% раствором мирамистина, либо раствором хлоргексидина). После обработки язвенного дефекта на рану накладывали атравматическую повязку. Так как наблюдаемые нами пациенты находились в первой стадии раневого процесса, у пациентов группы сравнения (группы 2) использовали перевязки с водорастворимыми мазями (левомиколь либо диоксиколь). Пациентам исследуемой группы (группы 1) выполняли перевязки с Суперлимфом, с новым иммуномодулятором разработанным на кафедре иммунологии РГМУ (регистрационный № 000516/01 – 2001), который представляет собой стандартизированный комплекс цитокинов, среди которых определена активность ИЛ - 1, 2, 6, фактора некроза опухоли-α (ФНО-α), фактора, ингибирующего миграцию фагоцитов (МИФ), ТФР-β.

В нашем исследовании мы использовали лиофилизированный порошок Суперлимфа: 1 ампулу сухого вещества препарата разводили в 2 мл 0,9% стерильного физиологического раствора и применяли локально на рану в виде аппликаций 1 раз в сутки в течение 7 дней.

Критериями оценки эффективности терапии служили клинические (динамика субъективной и неврологической симптоматики, эрадикация возбудителей из очага воспаления, динамика раневого процесса и локального статуса, сроки пребывания в стационаре), лабораторные (изменения в формуле периферической крови, ЛИИ, изменения в биохимических показателях) и иммунологические показатели (уровни цитокинов). Оценка эффективности лечения осуществлялась сразу после лечения.

Статистическая обработка данных проводилась с использованием статистического пакета программы Statistica vers. 6 и электронных таблиц MS EXCEL версия 2003 с применением стандартных параметрических методов вариационной статистики. Статистические данные приведены как средняя арифметическая М±δ, где δ - среднеквадратичное отклонение. В случае нормального распределения признака о достоверности различий средних величин судили по критерию Стьюдента t. При невыполнении условия нормальности распределения признака применяли непараметрические критерии Уилкоксона (для сравнения признака до и после лечения), Манна-Уитни (для сравнения признака между группами) и критерий Спирмена (r) (для расчета коэффициента корреляции). Сравнение групп по качественным признакам осуществлялось непараметрическим методом путем анализа таблиц сопряженности «2х2» с использованием критерия χ² (хи – квадрат); если ожидаемая частота признака составляла меньше 5, применялся точный двухсторонний критерий Фишера. Статистически значимыми считались отличия при р<0,05 (95%-й уровень значимости) и при р<0,01 (99%-й уровень значимости).
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

Результаты клинического и лабораторно-инструментального обследования.

У всех больных до проведения лечебных мероприятий выявлялись следующие жалобы: боли в стопах (97%), слабость в ногах и утомляемость (94%), парестезии(98%), судороги в икроножных мышцах (87%). При оценке клинических симптомов по Шкале Неврологических симптомов (NSS) подавляющее большинство пациентов (76,4%) имели тяжелую степень нейропатии (7-9 баллов). Анализ выраженности объективных проявлений диабетической нейропатии по шкале NDS показал, что значительное число пациентов 63 (87,5%) имели выраженную нейропатию, что подтверждает наличие у всех наблюдаемых нами пациентов язвенных дефектов стоп.

У всех больных до проведенных лечебных мероприятий отмечены изменения клинико-лабораторных данных (табл.2).
Табл.2 . Клинико-лабораторные показатели, лейкоцитарная формула и ЛИИ.

Показатель	1 группа(n=38)	2группа(n=34)
Температура (ºС)	37,3±0,5	37,2±0,4*
Пульс (уд/мин)	83,3±5,9	83,1±5,1*
Лейкоциты (тыс.)	10,4±1,6	10,9±1,3*
Нейтрофилы (%)	69,5±4,1	70,6±3,4*
ЛИИ	4,2±0,4	4,1±0,4*
СОЭ (мм/час)	35,1±7,2	38±9,5*

* р>0,05 – при сравнении признака 1 и 2 группы.

Все пациенты наблюдаемых групп с сахарным диабетом находились в стадии декомпенсации, о чем свидетельствуют значительные увеличения глюкозы крови натощак (10,8±1,1 ммоль/л в 1 группе и 11,3±1,7 во 2 группе) и уровня гликированного гемоглобина (HbA1c) (10,5±1,4 % в 1 группе и 10,5±1,2 во 2 группе). Кроме того, у 52 (72,2%) больных при исследовании мочи определялась глюкозурия, у 11 (15,3%) больных была выявлена кетонурия.

У всех пациентов наблюдаемых групп было проведено бактериологическое исследование локальной микрофлоры гнойно-некротического очага. Данные о наиболее часто выявленных микроорганизмах представлены в таблице 3.

Табл.3.