Автофлуоресцентная диагностика онкологических заболеваний гортани и глотки 03. 01. 02 биофизика 14. 01. 03 болезни уха, горла и носа



Дата01.07.2017
өлшемі272.49 Kb.
#18363
түріАвтореферат


+

на правах рукописи



Афонина Ольга Игоревна



АВТОФЛУОРЕСЦЕНТНАЯ ДИАГНОСТИКА ОНКОЛОГИЧЕСКИХ ЗАБОЛЕВАНИЙ ГОРТАНИ И ГЛОТКИ
03.01.02 - биофизика

14.01.03 – болезни уха, горла и носа


АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата медицинских наук

Саратов– 2010


Работа выполнена на кафедре оториноларингологии ГОУ ВПО «Саратовский ГМУ им. В.И. Разумовского Росздрава»


Научные руководители доктор медицинских наук, проф.

Мареев Олег Вадимович

кандидат химических наук,

Правдин Александр Борисович

Официальные оппоненты доктор медицинских наук, проф. Шахов А.В.

доктор физ.-мат. наук, проф. Ульянов С.С.


Ведущая организация ГОУ ВПО «Самарский Государственный

Медицинский Университет Росздрава»

Защита состоится «___17____»__06__2010 г. в _15.30_ часов на заседании Диссертационного Совета Д 212.243.05 при ГОУ ВПО «Саратовский Государственный Университет им. Н.Г. Чернышевского» в 34 аудитории III корпуса СГУ.


по адресу: 410012, г. Саратов, ул. Астраханская, 83.
С диссертацией можно ознакомиться в Зональной научной библиотеке ГОУ ВПО « Саратовский государственный университет им. Н.Г. Чернышевского»
Автореферат разослан «___»________ 2010 г.
Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор физ.-мат. наук, профессор В.Л. Дербов



ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ


Актуальность проблемы
В последние годы онкологическая заболеваемость неуклонно растет, возрастает и смертность от злокачественных новообразований. Рак гортани среди опухолей лор-органов составляет 12%-26% [Л1]. Для выявления опухоли разрабатывается и внедряется множество новых диагностических методик. Рутинные диагностические методы обнаружения опухолей относятся к традиционным, то есть на уровне клеток, тканей и органов, однако в последнее время усилилось внимание к микроскопическим методам диагностики - на молекулярном уровне. Одним из таких методов является спектральный анализ. Благодаря высокой чувствительности, этот метод позволяет определить содержание различных метаболитов в тканях человека (хотя в условиях измерений in vivo абсолютную концентрацию веществ достаточно точно, как правило, определить не удается) и связать их присутствие с состоянием метаболизма в норме и патологии.

В нашем исследовании использовался один из методов микродиагностики - флуоресцентная спектроскопия. Флуоресцентная спектроскопия - неинвазивный, высокочувствительный, универсальный и относительно простой в применении метод, допускающий комбинированную диагностику и возможность работы в реальном времени без повреждения исследуемой ткани. Его использование в диагностике различных заболеваний обусловлено тем, что в процессе развития патологий происходят биохимические изменения в ткани, а, следовательно, меняется относительное содержание основных флуорофоров и хромофоров, изменяются морфологические и гистологические параметры ткани и, как результат, их вклад в общий наблюдаемый спектр флуоресценции ткани.

Изучение автофлуоресценции биообъектов используется для диагностики атеросклеротических изменений сосудов [Л2], [Л3]. Флуоресцентные исследования ткани миокарда позволяют установить тонус сердечной мышцы [Л4]. Автофлуоресцентная спектроскопия применяется для мониторинга заживления ран и ожогов [Л5], многие работы посвящены изучению лазерной флуоресцентной спектроскопии кожи, дифференциальной диагностике новообразований эпидермиса [ Л6]-[Л12], исследованиям тканей глаза [Л13], [Л14], проводятся исследования в области оптических свойств злокачественных новообразований желудочно-кишечного тракта [Л15], шейки матки [Л16], [Л17] .

Вместе с тем, метод автофлуоресцентной диагностики широкого применения в медицинской практике пока не получил. В литературе недостаточно представлены данные по исследованиям оптических свойств злокачественных новообразований гортани и глотки человека.



Цель исследования:

Повышение эффективности ранней диагностики и профилактики онкологических заболеваний гортани и глотки с помощью метода автофлуоресцентной диагностики.

Поставленная цель достигалась путем решения следующих задач:


  1. Разработка лабораторно-клинического спектрального комплекса для регистрации УФ-индуцированной автофлуоресценции слизистой оболочки гортани и глотки.

  2. Проектирование и создание устройства для реализации возможности точечного зондирования слизистой оболочки гортани (гортанная насадка на световод).

  3. Разработка, на основе собственных результатов биопсии исследуемых тканей и привлечения гистохимических данных, механизма (модели) изменения УФ- индуцированных спектров автофлуоресценции при развитии доброкачественных и злокачественных новообразований слизистой оболочки. Использование разработанной модели для сопоставления данных автофлуоресцентной спектроскопии новообразований слизистой оболочки гортани и глотки с результатами их гистологического исследования.

  4. Сравнение характеристик полученных спектров автофлуоресценции слизистой оболочки гортани и глотки, злокачественных и доброкачественных новообразований гортани и глотки с целью выбора коэффициента диагностической контрастности (КДК).

Научная новизна и практическая значимость работы

Предложен новый, основанный на использовании лазерных технологий, способ точечного зондирования слизистой оболочки гортани и глотки, на основе получения, в выбранных локальных участках объекта, спектров автофлуоресценции, скорректированных с учетом спектральной чувствительности фотоприемной системы.

Разработанное устройство для реализации определения автофлуоресцентных характеристик слизистой оболочки гортани защищено патентом (Пат. РФ № 51847 от 10 марта 2006) , и внедрено в ЛОР-клинике СГМУ.

Определен диагностический критерий - КДК (коэффициент диагностической контрастности), позволяющий судить о степени злокачественности и границах новообразования, в том числе в случаях, когда визуально эти параметры неразличимы

Результаты работы и сформулированные в ней положения применяются в педагогическом процессе на кафедре оториноларингологии Саратовского государственного медицинского университета при обучении студентов, клинических ординаторов, клинических интернов и слушателей факультета повышения квалификации и профессиональной переподготовки (ФПК и ППС).

Достоверность результатов диссертации обеспечивается применением современных методов вариационной статистики, измерительной аппаратурой. При измерениях использованы стандартные спекрофлуометрические методики и приборы, калиброванные по спектральной чувствительности, проведен учет возможных погрешностей.



Личный вклад диссертанта и результаты, полученные совместно с другими исследователями:

Основные экспериментальные результаты диссертации, прежде всего по исследованию автофлуоресцентных свойств биотканей, забору исследуемого материала, проведению диагностических манипуляций пациентам были проведены лично соискателем. Постановка задач исследования и обсуждение экспериментальных результатов проведена под руководством профессора, д.м.н. Мареева О.В. и к.х.н., доцента Правдина А.Б. Гистологическое исследование экспериментального материала производилось совместно с заведующим патологоанатомическим отделением КБ СГМУ им. Миротворцева С.Р. Ивлиевым И.И.



Апробация работы

Материалы диссертации доложены на:

- 66-й научно-практической конференции студентов и молодых специалистов Саратовского государственного медицинского университета: “Молодые ученые – здравоохранению региона “ 24 марта 2005г. Саратов.

- IX International School for Young Scientists and Students on Optics, Laser Physics & Biophysics September 27-30, 2005, Saratov, Russia.

- Национальном конгрессе ринологов Казахстана и международной конференции молодых оториноларингологов, 5-7 октября 2005г. Шымкент-Туркестан.

- заседании Саратовского отделения Всероссийского научного общества отоларингологов имени профессора М.Ф. Цытовича, 10 марта 2006г. Саратов.

- заседании Саратовского отделения Всероссийского научного общества отоларингологов имени профессора М.Ф. Цытовича, 25 марта 2010г. Саратов.

- 71-й межрегиональной научно-практической конференции с международным участием «Молодые ученые - здравоохранению», посвященной 65-летию Победы в Великой Отечественной войне 22-24 апреля 2010г.



Публикации по теме диссертационной работы: опубликовано 11 печатных работ, в том числе 1 в журнале, включенном в Перечень ведущих рецензируемых научных журналов и изданий, в которых должны быть опубликованы основные научные результаты диссертаций на соискание ученых степеней кандидата и доктора наук. Получен патент на полезную модель № 51847 от 10 марта 2006 «Насадка к световоду».

Структура и объем работы. Диссертационная работа изложена на 119 страницах машинописного текста, иллюстрирована 27 рисунками, 20 таблицами, 14 фотографиями. Состоит из: введения, обзора литературы, главы о материалах и методах исследования, главы о результатах собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка литературы, включающего 177 источник, из которых 56 отечественных и 121 иностранных источника.

Содержание работы.


Во введении обоснована актуальность выбранной темы диссертации, сформулирована цель работы, приведены основные положения, выносимые на защиту, описаны структура и объем работы.

В первом разделе диссертации представлены результаты критического анализа известных методов диагностики онкологических заболеваний гортани и глотки, рассмотрены их достоинства и недостатки. Сделан вывод о том, что многие используемые методы диагностики являются длительными, недостаточно достоверными, связаны с большими материальными затратами, имеют ряд противопоказаний, травматичны для окружающих тканей, что в условиях онкологической патологии, требующей абластики, недопустимо. Определены основные проблемы, требующие дальнейших исследований.

Во втором разделе диссертации описаны материалы и методы исследования. Приведена схема лазерной установки, обеспечивающая возбуждение и регистрацию спектров автофлуоресценции слизистой оболочки гортани и глотки.

Схема экспериментальной установки представлена на рис.1.

Для возбуждения флуоресценции использовался азотный лазер ЛГИ-505 (1) (длина волны возбуждения 337 нм, частота повторения импульсов до 1 кГц, длительность импульса 6-10 нс). Регистрация спектров автофлуоресценции проводилась с помощью спектроанализатора с оптоволоконным вводом LESA-7med (7).

Волоконно-оптический зонд (3), представляет собой световод с двумя отводами. Один из них – центральное освещающее волокно, служит для подвода излучения к поверхности образца (рис.2). Вокруг центрального волокна размещены 6 световодов, предназначенных для сбора флуоресценции. Расстояние от центра освещающего волокна до центров принимающих волокон составляет 260 – 290 мкм. Собирающие люминесценцию волокна собраны во второй отвод, соединенный со спектроанализатором. Их торцы собраны в вертикальную линейную структуру, имитирующую входную щель спектрального прибора.





Рис.1 Схема экспериментальной установки. 1– источник возбуждающего излучения - азотный лазер ЛГИ-505 ( =337 нм), 2– линза, 3 – волоконно-оптический зонд, 4 –гортанная насадка, 5 – пациент, 6 – фильтр, 7 – полихроматор LESA 7-МЕД, 8 –персональный компьютер.






Рис. 2 Структура рабочего торца волоконно-оптического зонда.

Для размещения оптоволоконного зонда в полости гортани разработана гортанная насадка на световод (4), с дистальным концом волоконно-оптического датчика. Насадка представляет собой полую металлическую трубку диаметром 0.4-0,6 см с ручкой-держателем, через которую проходит световод. Конец трубки изогнут на расстоянии 4-5 см от рабочего торца под углом 100-110 градусов, что соответствует анатомической форме гортани. Немаловажной является возможность стерилизации насадки и, как следствие, ее многократное использование у различных пациентов (5).

Управление режимами работы спектроанализатора, регистрация и накопление спектров осуществлялась с помощью программного обеспечения, работающего под операционной системой Windows. Спектрограммы каждого пациента хранятся в архиве на базе ПК (8).

Для получения неискаженных спектров, перед началом экспериментов была проведена калибровка прибора на спектральную чувствительность и калибровка по длинам волн с использованием стандартных спектральных источников.



In vivo исследования, которые заключались в регистрации спектров автофлуоресценции новообразований слизистой оболочки гортани и ротоглотки, проводились на базе КБ СГМУ им. С.Р. Миротворцева г. Саратова по протоколам, рекомендованным комитетом по этике ГОУ ВПО «Саратовский государственный медицинский университет».

При проведении серии измерений задавалась постоянная (по отношению к контрольному образцу) интенсивность азотного лазера, равная 1600 относительных единиц.

Спектры фиксировались путем прямого контакта (касания) световода с поверхностью слизистой оболочки под углом 90%. Таким образом, осуществлялся процесс точечного зондирования новообразования и слизистой оболочки по периферии. Для исследования были выбраны 3 зоны: центральная часть новообразования; периферия новообразования (зона визуальной границы со здоровой тканью); видимо неизмененная ткань (здоровая). Для каждой локализации проводилось 3-4 измерения, полученные данные усреднялись.

Чтобы избежать болезненных ощущений и рвотных рефлексов у пациентов, исследования проводились под местной анестезией (лидокаин 10%).

Так как спектр автофлуоресценции ткани даже одной и той же локализации сильно варьирует от пациента к пациенту, при измерениях на каждом пациенте регистрировали в качестве реперной точки спектры автофлуресценции язычной поверхности надгортанника (при исследованиях гортани) или малого язычка (при исследованиях глотки).

Критерии включения в исследование:

- возраст от18 до 70 лет;

- новообразование гортани и (или) глотки (доброкачественное или злокачественное), верифицированное или требующее гистологического обследования;

- хроническое заболевание гортани или глотки, требующее последующего гистологического исследования;

- согласие на участие в исследованиях;

- здоровые лица ( контрольная группа).



Критерии исключения

- беременные и кормящие;

- подвергшиеся местному инвазивному методу лечения или диагностики по поводу перечисленных заболеваний в течение последних 3 недель;

- анатомо-физиологические особенности, препятствующие проведению исследования;

- применявшие антибиотики тетрациклинового ряда последние 2 недели (данный критерий связан с наличием сильной люминесценции тетрациклина);

- подвергшиеся диагностическим мероприятиям с введением экзогенных флуорофоров.

В дополнительных мерах предосторожности до и после диагностического измерения пациенты не нуждаются.

При еx vivo наблюдениях исследовались биоптаты новообразований слизистой оболочки гортани и глотки, полученные во время операции (биопсии), а также гортань и фрагменты слизистой оболочки глотки, полученные в результате ларингэктомии и циркулярной резекции глотки.

Перед измерениями препараты отмывались от видимых следов крови физиологическим раствором.

Измерения проводились, по возможности, в таких же условиях касания образца торцом оптоволоконного зонда, как и измерения in vivo. Исследования проводились не позже, чем через 5 часов после удаления участков ткани. Образцы при этом хранились в физиологическом растворе.



Обработка полученных результатов

КДК – коэффициент диагностической контрастности параметр по численному значению которого выносится диагностическое решение. КДК вычислялся по соотношению значения интенсивности автофлуоресценции в подозрительном на наличие новообразования участке, к значению интенсивности автофлуоресценции неизмененной слизистой оболочки, то есть:



КДК= I1/I2,

где I1- интенсивность автофлуоресценции новообразования, I2 - интенсивность автофлуоресценции здоровой слизистой оболочки обследуемого на той же длине волны. Для определения длины волны, при которой значение КДК наиболее информативно, в процессе исследований расчет проводился по всему спектру.

Важной особенностью КДК является то, что при его расчете сопоставляются измеренные значения физических параметров в опухолевых тканях и неизмененных тканях этого же пациента, что позволяет исключить влияние структурно-функциональных особенностей тканей обследуемых лиц.

В связи с тем, что спектры флуоресценции могут зависеть как от особенностей структуры и состава исследуемого участка, так и от условий зондирования (угол наклона зонда, сила прижима и т.д.), для получения достоверных данных нами проводился набор статистики. При проведении флуоресцентной диагностики получали большое количество измеренных спектров (не менее 12 от каждого обследуемого). По полученным данным рассчитывались средние значения интенсивности флуоресценции нормальных участков (Iфл.н.) и флуоресценции опухоли (Iфл.о.) для каждого пациента. Эти значения использовались для определения КДК здоровой и пораженной новообразованием слизистой оболочки у каждого пациента.

Для регистрации и архивирования данных, полученных в результате исследования всех групп пациентов, был составлен протокол исследования, в который вносились паспортные данные, предварительный и заключительный диагнозы, дата исследования, номера файлов с результатами спектроскопии. Полученные в результате обследования спектры автофлуоресценции заносились в базу данных.

Весь исследуемый материал, после произведенных измерений, направлялся в патологоанатомическое отделение КБ СГМУ им. С.Р. Миротворцева, для гистологического исследования.

Эффективность автофлуоресцентной спектроскопии определяли на основании сравнения данных спектроскопии (расчет КДК, анализ формы спектра и значений интенсивности автофлуоресценции) с результатами, полученными при гистологическом исследовании. Статистическая обработка результатов исследования проведена с помощью компьютерной программы Mathcad 2001 Professional.

В исследовании принимали участие 50 больных от 18 до 70 лет, контрольную группу составили 10 человек без патологии со стороны гортани и глотки (таб. 1).

Таблица № 1. Группы исследования.

группы

I

II

III

Диагноз

Злокачественное новообразование гортани или глотки

Доброкачественное новообразование гортани или глотки

Здоровые

Количество

31

19

10

Мужчины

31

16

8

Женщины

0

3

2

Исследования проводились в условиях ex vivo и in vivo. Количественное соотношение видов исследования представлено в таблице 2.

Таблица №2.Количественное соотношение видов исследования.




Исследуемый орган

Исследование in vivo

Исследование ex vivo

Гортань

24

11

Глотка

15

0


РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ


В третьей главе проведен анализ данных, полученных при проведении метода автофлуоресцентной спектроскопии, а также их сопоставление с диагнозами, которые были установлены на основании клинических и гистологических результатов обследования.

При обследовании 31 пациента со злокачественными новообразованиями гортани и глотки (группа I) получены характерные спектрограммы, представленные на рис.3.



а б


Рис.3 Спектр автофлуоресценции новообразования больного 16. а – экспериментальные спектры, б – спектры, нормированные на максимальное значение

Величина интенсивности автофлуоресценции для каждого исследования усреднялась, как минимум, по трем измерениям.

Во всех рассмотренных случаях плоскоклеточного рака регистрировались спектры с большой разницей интенсивностей автофлуоресценции здоровой и опухолевой ткани и характерными максимумами на 370 нм и 440 нм. Характерной особенностью всех проведенных нами измерений является значительно сниженная интенсивность автофлуоресценции в очаге малигнизации. Интенсивности спектров автофлуоресценции рака располагались в интервале от 0,1 до 0,5 относительных единиц.

Средняя интенсивность автофлуоресценции плоскоклеточного рака на длине волны 440 нм равнялась 0,25±0,09 отн.ед., при коэффициенте вариации 36%. Средняя интенсивность визуально здоровой слизистой оболочки составляла 2,91±0,45 отн.ед., коэффициент вариации 15,1%.

Исходя из полученных данных, вычислялся коэффициент диагностической контрастности (КДК) – диагностический критерий, позволяющий предположить наличие злокачественного новообразования на конкретно взятом участке слизистой оболочки. Среднее значение КДК в группе обследованых со злокачественными новообразованиями гортани и глотки равнялось 14,56±5,59. Коэффициент вариации 37,8%. По спектру наблюдается незначительное изменение КДК, однако, наибольшие различия норма/патология получены в области 400 нм.

Наряду с общим уменьшением интенсивности флуоресценции по мере развития злокачественного новообразования наблюдается смещение максимальной интенсивности в спектре от 408-410 нм для нормы до 435-455 нм в случае новообразования. По мере продвижения к центру опухоли это смещение становится более выраженным.

Характер спектров при изменении локализации зондирования проявляет явную корреляцию с морфологическим строением и соответствует понятию о гистологическом строении злокачественной опухоли и здоровой слизистой оболочки гортани и глотки (рис.4), (рис.5).



Для всех обследованных образцов биопсии раковой опухоли, гистологически характерно резкое истончение и (или) изъязвление поверхностного эпителия, сама опухоль представляет собой скопление хорошо дифференцированных клеток плоского эпителия с обильной эозинофильной инфильтрацией. Ядра опухолевых клеток подвергаются дисплазии, количество фигур митоза незначительное. Наблюдаются очаги роговых кист (кератинизация). Соединительнотканная строма возле поверхности незначительно инфильтрирована лимфоцитами. В клеточной массе плоскоклеточного рака крайне малое количество коллагена и эластина – основных флуорофоров соединительной ткани, которые флуоресцируют при длине волны возбуждения 337,1 нм. Клетки плоскоклеточного рака содержат кератиновые включения, не характерные для клеток здоровой слизистой. Однако кератин является хромофором, интенсивность флуоресценции которого крайне мала, поэтому его наличие не приводит к значительному повышению интенсивности автофлуоресценции опухолевой массы. Для центральной зоны зрелой плоскоклеточной злокачественной опухоли характерна низкая митотическая активность, низкое содержание дыхательных ферментов. Перестройка в биоэнергетических процессах клетки (преобладание анаэробного гликолиза) приводит к уменьшению концентрации окисленных форм дыхательных коферментов НАДН и НАДФН. [Л18]. Флуоресценция белков и коферментов НАДН, НАДФН находится в области длин волн 450-460 нм, и возбуждается излучением 337,1 нм. Низкое содержание НАДН в опухолевых клетках, а также развивающаяся при злокачественных заболеваниях диспротеинемия также являются причиной снижения интенсивности спектра автофлуоресценции. Как уже отмечалось, спектр автофлуоресценции состоит в совокупности из автофлуоресценции флуорофоров как самой слизистой оболочки, так и флуорофоров подлежащих тканей. Однако, вследствие гистологических особенностей, указанных выше, опухолевая масса является экраном для самого лазерного возбуждающего излучения, т.к. рассеивает испускаемое флуорофорами излучение. Кроме того, существенное влияние оказывает также поглощение флуоресценции гемоглобином в области 400-420 нм, что также приводит к снижению интенсивности спектров автофлуоресценции опухоли. Поглощение гемоглобином света в области полосы Соре (400-425 нм) является причиной провала в полученных спектрах флуоресценции, однако, изменение положения минимума спектральной зависимости в этой области (417 нм для нормы и 412 для патологии) нельзя объяснить только изменением относительных концентраций различных форм гемоглобина (окси- деокси- и метгемоглобин). Определенный вклад в изменение данного положения дает также вклад флуоресценции НАДН. Это подтверждается явным смещением длинноволнового максимума в спектрах новообразования до 445-450 нм. Наиболее явно такое смещение проявляется в нормированных спектрах. Очевидно, что, несмотря на малое содержание НАДН в контролируемой области, эффекты экранировки флуоресценции коллагена приводят к тому, что, для злокачественных опухолей, флуоресценция НАДН в центре опухоли преобладает. Данное смещение можно объяснить приводящим к относительному увеличению флуоресценции НАДН связыванием НАДН с белками при одновременном экранировании флуоресценции коллагена.

Рис. 4 Гистологический препарат, соответствующий спектру центральной части неороговевающего рака гортани.

При обследовании 19 пациентов с доброкачественными новообразованиями гортани и глотки (группа II), характерным является график, представленный на рис.6.



Рис.5 Гистологический препарат, соответствующий спектру здоровой слизистой оболочки гортани.






Рис. 6 Спектры автофлуоресценции фибромы гортани ex vivo (больной 17).

При изучении графиков, выявлены следующие закономерности: во всех представленных спектрах доброкачественных новообразований гортани и глотки интенсивность автофлуоресценции новообразования расположена от 1,3±0,12 до 3,8±0,13 отн.ед. Данные, полученные ex vivo, отличаются наличием минимумов в спектрах, соответствующих полосам поглощения гемоглобина - полосы Сорэ (рис.6). Это связано с неизбежным загрязнением образца кровью во время его удаления. Спектров, снятых с поверхности новообразования, с интенсивностью от 0,5 отн.ед. и ниже зафиксировано не было.

Средняя интенсивность автофлуоресценции доброкачественных новообразований гортани и глотки равна 2,03±0,71 отн. ед., при коэффициенте вариации 33,9%. Средняя интенсивность автофлуоресценции визуально здоровой слизистой оболочки 3,04±0,42, коэффициент вариации 13,4%. Изменения формы спектров флуоресценции доброкачественных новообразований сильно зависит от типа образования, места расположения, структуры и состава. В отличие от спектров плоскоклеточного рака, выявить какие-либо постоянные зависимости в спектрах in vivo не удалось. В каждом отдельном случае необходимо внимательно сопоставлять изменения в спектрах с результатами гистологического анализа.

Данные автофлуоресцентной спектроскопии доброкачественных новообразований гортани и глотки соответствовали данным гистологического исследования во всех рассмотренных случаях. В процессе обработки этих данных получено среднее значение коэффициента диагностической контрастности (КДК) для доброкачественных новообразований гортани и глотки. КДК=1,6±0,41. Коэффициент вариации равнялся 24,8%.

Для пациентов группы исследования II (доброкачественные опухоли гортани и глотки), характерны следующие гистологические особенности:

Гортанный (певческий) узелок состоит из типичной эозинофильной неплотной клеточной соединительной ткани, в которой находятся расширенные тонкостенные кровеносные сосуды. Многослойный плоский эпителий голосовой складки вакуолизирован. В строме содержится сравнительно мало клеток и большое количество гиалинизированного коллагена. В некоторых узелках строма богата сосудами и почти гемангиоматозная, а в остальных она более плотная и фиброзированная.

Папиллома состоит из множества сосочковых выростов, которые состоят из васкулярной основы соединительной ткани, покрытой толстым слоем хорошо дифференцированного плоского эпителия. Ядра клеток эпителия базофильные, в них наблюдается значительная митотическая активность. Расположенный ниже эпителий гортани сдавлен папилломой и атрофирован, а подслизистая основа инфильтрирована клетками, имеющими место при хроническом воспалении.

Исходя из вышесказанного, интенсивность автофлуоресценции доброкачественных образований может быть обусловлена следующими факторами:

1. По сравнению с плоскоклеточным раком, клетки доброкачественной опухолевой массы расположены более рыхло, эпителий сильно вакуолизирован, что в свою очередь улучшает условия возбуждения автофлуоресценции подлежащей коллагенизированной ткани, снижает эффект экранировки.

2. Митотическая активность клеток доброкачественных новообразований значительно выше митотической активности клеток плоскоклеточного рака, следовательно, увеличивается содержание дыхательных ферментов (НАДН). НАДН является одним из основных активных флуорофоров при длине волны возбуждения 337,1 нм. Это хорошо подтверждается сравнением отношений интенсивностей длинноволнового и коротковолнового максимумов полученных спектров. Для доброкачественных новообразований, в большинстве случаев, характерно преобладание длинноволнового пика, соответствующего флуоресценции НАДН.

3. Значительно снижен эффект “экрана”, описанный в случае плоскоклеточного рака, следовательно, в формировании спектра автофлуоресценции доброкачественного новообразования более активно принимают участие флуорофоры подлежащих тканей.

4. Некоторые доброкачественные новообразования (фибромы), в своей строме содержат большое количество гиалинизированного коллагена, который является, при использованном методе возбуждения, основным флуорофором.

При анализе данных контрольной группы (III) получены следующие данные: средняя интенсивность автофлуоресценции здоровой слизистой гортани и глотки равна 2,96±0,13 отн.ед., коэффициент вариации15%.

Табл.3 Сравнительная характеристика основных диагностических показателей автофлуоресцентной спектроскопии новообразований слизистой оболочки гортани и глотки

Основные диагностические показатели

Группа исследования I

Группа исследования II

Группа исследования III


Средняя интенсивность автофлуоресценции новообразования (отн. ед.)

0,20±0,06

2,03±0,71

Средняя интенсивность автофлуоресценции здоровой слизистой оболочки (отн. ед.)

2,96±0,34

3,04±0,42

2,96±0,13

Коэффициент диагностической контрастности (КДК)

14,56±5,59

1,60±0,41

1,0


Основные положения, выносимые на защиту

1. Разработан лабораторно-клинический комплекс, воспроизводящий в широком спектральном диапазоне спектр автофлуоресценции слизистой оболочки гортани и глотки. Комплекс позволяет исследовать влияние злокачественного новообразования на формирование спектра автофлуоресценции, гортанная насадка на световод дает возможность использовать метод точечного зондирования, что определяет для экзофитных новообразований распространенность процесса с точностью до 1 мм.

2. На основе точечного гистологического исследования образца плоскоклеточного неороговевающего рака и данных биопсии в точках снятия спектра автофлуоресценции показано, что, фиксируемый спектр автофлуоресценции изменяется синхронно с изменение митотической активности, начиная со здоровой слизистой оболочки, через переходную зону с определяющимися клетками злокачественной опухоли, к центру (некрозу) новообразования.

3. При применении созданного комплекса, среднее значение отношения значений интенсивности автофлуоресценции в спектрах злокачественного новообразования и здоровой слизистой равно 14,56± 5,59, для доброкачественного новообразования эта величина составляет 1,60±0,41.

4. Для плоскоклеточного рака характерно, наряду с общим уменьшением интенсивности флуоресценции, появление главного максимума спектра в области 435-455 нм. Данный факт можно объяснить приводящим к относительному увеличению флуоресценции НАДН связыванием НАДН с белками при одновременном экранировании флуоресценции коллагена.
Основные результаты и выводы
1. Для проведения сравнительной характеристики спектров автофлуоресценции (возбуждение излучением азотного лазера, λ=337 нм) участков слизистой оболочки, подозрительных на наличие злокачественного образования, оптимальными в качестве диагностических критериев считать параметры, полученные на длине волны 440 нм.

2. Путем сопоставления данных, полученных в результате автофлуоресцентной спектроскопии и гистологического исследования идентичных участков слизистой оболочки, выявлено, что злокачественные новообразования слизистой оболочки гортани и глотки имеют значение КДК≥ 14,56±5,59.

3. Предложенная методика автофлуоресценции слизистой оболочки гортани и глотки дает возможность, при первичном обследовании, провести дифференциальную диагностику доброкачественных и злокачественных новообразований, позволяет хранить информацию в электронном виде для последующего динамического наблюдения за больным.

4. Использование метода точечного зондирования при проведении автофлуоресцентной спектроскопии, оптимизирует выявление распространенности опухолевого процесса.

5. Использование метода автофлуоресцентной спектроскопии слизистой оболочки гортани и глотки дает возможность произвести прицельную биопсию новообразования.

6. Определенные в ходе исследования коэффициенты диагностической контрастности (КДК), позволяют оптимизировать дальнейшую лечебную тактику.

7. Автофлуоресцентная спектроскопия является простым, безопасным, неинвазивным методом и может быть рекомендована в качестве экспресс-диагностики для выявления злокачественных новообразований гортани и глотки. Позволяет проводить первичный скрининг при формировании групп риска по развитию онкологических заболеваний гортани и глотки.
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. При проведении метода автофлуоресцентной спектроскипии измерения проводятся при легком контакте световода со слизистой гортани или глотки, перпендикулярно к исследуемой поверхности. Визуальный контроль обеспечивается стандартной процедурой непрямой ларингоскопии, орофарингоскопией, мезофарингоскопией, при условии выключения источника света в момент регистрации показаний.

2. Автофлуоресцентную спектроскопию проводят в самом начале клинического обследования, до применения инвазивных методов диагностики.

3. Для исследования рекомендовано выбирать 3 зоны новообразования: центральная часть новообразования; периферия новообразования (зона визуальной границы со здоровой тканью); видимо неизмененная ткань (здоровая). За реперную точку принимать слизистую надгортанника, либо идентичную поражению, неизмененную слизистую противоположной стороны гортани или глотки. Для каждой локализации проводить 3-4 измерения, полученные данные усреднять.

4. Пациенты с низкой интенсивностью автофлуоресценции слизистой оболочки гортани и глотки (от 0,25±0,09 отн.ед. и ниже) в зоне, подозрительной на наличие новообразования, считаются группой риска, и подлежат обязательному гистологическому исследованию новообразования.

Список цитируемой литературы





Л1. Абызов Р.А. Онкоотоларингология / Р.А.Абызов. Киев. - 2001. - 264с.

Л2. Ораевский А.А., Летохов В.С., Рагимов С.Э. и др. Спектральная диагностика атеросклеротических бляшек в сосудах человека // Изв. АН ССР. Сер. Физическая. - 1990. - Т. 54. - № 10. - С. 1900-1903.

Л3. Svanderg S. New developments in laser medicine // Phys. Scripta. - 1997. - Vol. T72. Р. 69-75.

Л4. Yang Y., Mitchel L.D., Alfano R.R. Fluorescence spectroscopy of dermal wounds in rats // J.Biomed. Opt. - 1997. - Vol. 2. - N 1. Р. 53 - 57.

Л5. Lohmann W., Mussmann J., Lohmann C., Kunzel W. Native fluorescence of the cervix uteri as a marker for dysplasia and invasive carcinoma // Europ. J. оf Obstet. & Gynecol. and Reprod. Biol. - 1989. - Vol. 31. - P.249-253.

Л6. Pravdin A.B.,Chernova S.P., Papazoglou T.G., Tuchin V.V. Tissue phantoms //Handbook of Optical Biomedical Diagnostics / V.V.Tuchin, editor.Bellingham: SPIE Press, 2002. - P.311-352.






Л7. Pravdin A., Utz S., Al'khov A., Bashkatov A. Upper epidermis autofluorescence dynamics under laser UV irradiation // Proc. SPIE. - 1994. - Vol. 2100. - P.233-236.

Л8. Тучин В.В. Лазеры и волоконная оптика и биомедицинских исследованиях. - Саратов: Изд-во Саратовского ун-та, 1998. - 384 с.

Л9. Утц С.Р.,Синичкин Ю.П., Пилипенко Е.А. In vivo лазерная флуоресцентная спектроскопия кожи человека: влияние эритемы // Опт. спектр. - 1994. - Т.76. - № 5. - С.864-868.

Л10. Anderson R.R., Parrish L.S. Optical properties of human skin // The science of photomedicine / J.D.Regan and J.A.Parrish, Eds. Plenum, New York, London, 1982. - P. 147 - 194.

Л11. Ambach W., Blumthaler M., Schopf T., Ambach E., Rabl W., Zelger B., Hinter H. Optical characteristics of UV transmission of normal human epidermis // Z.Med. Phys. - 1994. - N 4. - P.65-68.

Л12. Davis R., Savage H., Sacks P., Alfano R., Schantz S. The influence of keratin on native cellular fluorescence of human skin // Pros. SPIE. - 1996. - Vol. 2679. P. 216-226.

Л13. Yappert M.C., Borchman D., Byrdwell W.C. Comparison of specific blue and green fluorescence in cataractous versus normal human lens fractions // Invest. Ophthal. Vis. Sci. - 1993. - Vol. 34. - N 3. Р. 630-636.

Л14. Lohmann W., Schill W.-B., Bucher D., Peters T., Nilles M., Schulz A., Bohle R., Schramm W. Tissue diagnosis using autofluorescence // Pros.SPIE. - 1993. - Vol. 2081. P.10-25.

Л15. Tamosiunas M., Makaryceva J., Labonauskiene J. Autofluorescence of transplantable hepatoma A22 (MH-A22): prospects of tumor tissue optical biopsy// Experimental oncologu. - 2004. 26, 2. P.118-124

Л16. Vasileiou A., Koumantakis E., Makriginnakis A., Liu W., Fotakis C., Papazoglou T. In vitro and in vivo laser induced fluorescence detection of malignancies in the female reproductive system via their natural emission and hypocrellin probing //OSA TOPS on Medical and Biological Applications. - 1996. - N 6. - P.62-67.

Л17. Ramanujam N., Mitchell M.F., Mahadevan A., Warren S., Thomsen S., Silva E.,Richards-Kortum R. In vivo diagnosis of cervical intraepithelial neoplasia using 337 nm excited laser induced fluorescence // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1994. -Vol. 91. - P. 10193-10197.

Л18. Черницкий Е.А., Слобожанина Е.И. Спектральный люминесцентный анализ в медицине. – Минск: Наука и техника, 1989. - 141 с.

















СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
1. Мареев О.В. Возможности автофлуоресцентной спектроскопии в диагностики новообразований гортани и глотки / О.В.Мареев, А.Б.Правдин, О.И.Афонина, Е.В.Филина // Вестник оториноларингологии. – 2008.- №1.-С.39-41.

2. Мареев О.В. Автофлуоресцентная спектроскопия в применении к задачам диагностики неоплазии глотки и гортани / О.В.Мареев, А.Б.Правдин, О.И.Афонина, Е.В.Филина // Проблемы оптической физики. Материалы 10-й международной молодежной научной школы по оптике, лазерной физике и биофизике. Саратов, 2006.- С.93-100.

3. Marjev O.W. Die Autofluoreszenz als Diagnostiksmethode der Kehlkopfkrebserkrankungen / Marjev O.W., A.B. Prawdin, O.I.Afonina //Патология респираторного тракта: Материалы II национального конгресса ринологов Казахстана и Международной конференции молодых оториноларингологов – Астана-Шымкент, 2005. – С.288-289.

4. Свидетельство №51847 РФ, МКИ А 61 В 1/00 Гортанная насадка на световод / О.В.Мареев, О.И.Афонина (РФ;СГМУ). - №2005121956; Заявл.11.07.05; Опубл.10.03.06. Бюл. №7. – С.2.

5. Афонина О.И. Автофлуоресцентная картина препарата плоскоклеточного неороговевающего рака гортани с гистологическим исследованием / О.И.Афонина, О.В.Мареев, А.Б.Правдин // Материалы III Международной научной онкологической конференции «Онкология – XXI век» г.Эйлат, Израиль. Часть II. – Пермь: Изд-во Поницаа.,2008. –С.12-14.

6. Афонина О.И. Автофлуоресцентная диагностика онкологических заболеваний гортани и глотки на ранних стадиях развития / О.И. Афонина //Современные проблемы развития амбулаторно-поликлинической помощи и общеврачебной практики. -2006. -№1. – С.239-241.

6. Мареев О.В. Автофлуоресцентная диагностика ранних стадий рака гортани и глотки/ О.В. Мареев, А.Б. Правдин, О.И. Афонина // Материалы XVII съезда отоларингологов России – Санкт-Петербург, 2006. – С.386-387.

7. Афонина О.И. Особенности автофлуоресцентной спектроскопии злокачественных новообразований гортани и глотки / О.И.Афонина,Е.В.Филина // Молодежь и наука: итоги и перспективы. Материалы межрегиональной научно-практической конференции студентов и молодых ученых с международным участием. –Саратов, 2006. – С. 263.

9. Мареев О.В. Возможности спектрально-флуоресцентной диагностики опухолевых заболеваний гортани и глотки / О.В.Мареев, А.Б. Правдин, О.И.Афонина, И.И.Ивлиев // Сборник научных статей. Материалы II научно-практической конференции оториноларингологов Южного федерельного округа. – Майкоп,2006.-С. 113.

10. Афонина О.И. Оптическая биопсия как метод диагностики плоскоклеточного неороговевающего рака гортани / О.И.Афонина // Молодежь и наука: итоги и перспективы. Сборник тезисов по материалам III осенней научн.-практ. конф. студентов и молодых ученых СГМУ – Саратов,2005. – С.142-143.



11. Афонина О.И. Автофлуоресценция как метод диагностики заболеваний гортани / О.И.Афонина // Молодые ученые – здравоохранению региона: материалы 66-ой научн.-практ.конф. студентов и молодых специалистов СГМУ – Саратов, 2005. – С.136-137.




Достарыңызбен бөлісу:




©stom.tilimen.org 2022
әкімшілігінің қараңыз

    Басты бет