Активность фенилаланин-аммиак-лиазы в каллусных культурах сахарной свеклы, инфицированных ахолеплазмой



Pdf көрінісі
Дата24.08.2018
өлшемі81.59 Kb.

81

ISSN 0201-8462. ̳êðîá³îë. æóðí., 2012, Ò. 74, ¹ 5

УДК: 577.15:579.887



Л.П. Панченко, Е.С. Коробкова

Институт микробиологии и вирусологии им. Д.К. Заболотного НАН Украины,

ул. Академика Заболотного, 154, Киев, МСП, Д 03680, Украина 

АКТИВНОСТЬ ФЕНИЛАЛАНИН-АММИАК-ЛИАЗЫ 

В КАЛЛУСНЫХ КУЛЬТУРАХ САХАРНОЙ СВЕКЛЫ, 

ИНФИЦИРОВАННЫХ АХОЛЕПЛАЗМОЙ 

Изучено влияние Acholeplasma laidlawii var.granulum шт.118 на активность фенилаланин-аммиак-

лиазы (ФАЛ, КФ 4.3.1.5) в каллусах сахарной свеклы. Оптимальными условиями проведения фермента-

тивной реакции были: использование в качестве субстрата L-фенилаланина, рН 8,4-8,8, температурный 

оптимум 38-40 

0

С. Установлено, что при заражении каллусной культуры сахарной свеклы фитопато-

генным молликутом происходит временное возрастание активности ФАЛ, которое через 2 часа после 

инфицирования достигает максимального значения и, постепенно снижаясь, через 24 ч достигает пер-

воначального уровня. Увеличение активности ФАЛ растения рассматривается как защитная реакция в 

ответ на действие патогена.

Ключевые слова: фенилаланин-аммиак-лиаза, каллусы, стресс, Acholeplasma laidlawii, молликуты.

Фенилаланин-аммиак-лиаза (ФАЛ,  КФ 4.3.1.5) является ключевым ферментом фенилп-

ропаноидного биосинтеза и участвует в синтезе соединений, играющих важнейшую роль в 

индуцировании неспецифической устойчивости растений к стрессорам [2,5]. Фермент обрати-

мо катализирует реакцию дезаминирования L-фенилаланина с образованием транс-коричной 

кислоты  и  аммиака.  С  этой  реакции  начинается  синтез  широкого  спектра  вторичных  мета-

болитов:  фенолов,  фенилпропаноидов,  мономеров  лигнина,  салициловой  кислоты  и  других 

соединений, необходимых для развития растений и защиты их от неблагоприятных факторов 

среды [2,6,7,11]. 

Известно, что под воздействием различных стрессовых факторов активность ФАЛ в тка-

нях растений может значительно изменяться за короткий промежуток времени [3,4,7,12]. Та-

кими факторами могут быть механические повреждения, свет, влияние элиситоров и инфекция 

патогенными организмами. Учитывая высокую мобильность ФАЛ в ответ на разнообразные 

стрессоры и ее ключевую роль в синтезе соединений, принимающих участие в защитных ре-

акциях, некоторые авторы считают, что данный фермент может служить маркером устойчи-

вости к болезням растений [5,11].

Микоплазмозы растений достаточно широко распространены, однако сведений о вовлече-

нии ферментов фенольного обмена,  в частности ФАЛ, в процессы развития защитных реакций 

растений при инфицировании микоплазмами в доступной нам литературе не обнаружено.

В связи с вышеизложенным, целью работы было изучение изменений активности фенила-

ланин-аммиак-лиазы каллусов сахарной свеклы, инфицированных ахолеплазмой.

Материалы и методы. 

Эксперименты были выполнены в модельной системе in vitro, созданной на основе каллу-

сов растений, инфицированных клетками фитопатогенных микоплазм [4]. Использовали кле-

точные культуры  сахарной свеклы СК60/2, любезно предоставленные к.б.н., старшим науч-

ным сотрудником Института сахарной свеклы НААН Украины В.И. Редько. Каллусы культи-

вировали на агаризованной среде Гамборга-Эвелега [14]. Инокуляцию проводили на 21 сутки 

после пассажа растительной культуры фитопатогенным молликутом A. laidlawii var.granulum 

шт.118 из Национальной коллекции микроорганизмов Украины, сохраняющейся в Институте 

микробиологии и вирусологии НАНУ. Ахолеплазму культивировали на питательной среде СМ 

ИМВ-72 [10].

В  качестве  источника  ферментов  использовали  экстракт  каллусной  культуры  сахарной 

свеклы.  1 г свежезамороженного материала  растирали в 5-кратном объеме (вес/объем) 0,1М 

Na-боратного  буфера  (рН 8,8), содержащего 1,0 М  ЭДТА, 1,0 мМ  дитиотрейтола, 25 мг/мл 

нерастворимого поливинилпиролидона (“Serva”, Германия) [9]. Экстракцию выполняли в те-

чение 40-60 мин при осторожном перемешивании на холоде. Полученный гомогенат центри-

фугировали при 4

0

С в течение 20 мин при 15000 g, осадок отбрасывали, а надосадочную жид-



кость использовали в качестве экстракта фермента. Содержание белка определяли по методу 

Бредфорда [13].

© Ë.Ï. Ïàí÷åíêî, Å.Ñ. Êîðîáêîâà, 2012


ISSN 0201-8462. ̳êðîá³îë. æóðí., 2012, Ò. 74, ¹ 5

82

Активность ФАЛ определяли спектрофотометрически при 290 нм по образованию транс-

коричной кислоты [15]. Реакционная смесь содержала 0,1 М  Na-боратного буфера (рН 8,8), 

1,0 мМ L-фенилаланина, D-фенилаланина или тирозина (“Serva”, Германия) (по условиям экс-

перимента) и экстракт ферментов (общий обьем смеси 2 мл). Инкубацию проводили в течение 

1ч  при  температуре  от 25 до 45 

0

С  (согласно  условиям  эксперимента).  Контролем  служили 



пробы, в которых вместо экстракта добавляли боратный буфер. Реакцию останавливали до-

бавлением в реакционную смесь 0,5 мл 1М ТХУ Активность ФАЛ выражали в единицах оп-

тической плотности  (∆E/мг белка).

Опыты проводили в трех повторностях. Графические результаты получены с использова-

нием компьютерных программ – прикладной пакет Microsoft Excel 2000.

Результаты и их обсуждение. Для изучения изменений активности ФАЛ каллусной куль-

туры  сахарной  свеклы,  инфицированных  ахолеплазмой,  следовало  оптимизировать  условия 

проведения эксперимента – установить необходимое содержание L-фенилаланина как основ-

ного субстрата фермента, изучить ход реакции при внесении иных субстратов субстрате D-фе-

нилаланина и L-тирозина, выявить наиболее благоприятные для активности ФАЛ  показатели 

рН и температуры.

Изучение  зависимости  активности  ФАЛ  в  каллусах  сахарной  свеклы,  инфицированных 

A. laidlawii var.granulum шт.118, от содержания в реакционной смеси L-фенилаланина показа-

ло, что увеличение концентрации данного субстрата в испытуемой смеси значительно влияло 

на скорость ферментативной реакции (рис. 1). 

0,0 


 

4,0 


 

8,0 


 

12,0


 

16,0


 

0,2 0,4


0,6

0,8


1,0

1,2


 



 /

 

Рис. 1. Влияние концентрации L-фенилаланина на активность ФАЛ клеток каллусов 



сахарной свеклы, инфицированных A. laidlawii var. granulum шт.118.

Содержание L-фенилаланина, при котором проявлялась максимальная активность ФАЛ 

каллусных  тканей  сахарной  свеклы,  составляло 1,0 мМ.  Именно  это  количество  субстрата 

использовалось нами в дальнейшем при исследовании других свойств ФАЛ. 

Исследование  субстратной  специфичности  ферментного  препарата  из  каллусов  сахар-

ной  свеклы,  инфицированных  культурой  фитопатогенного  молликута,  показало,  что  при 

внесении в реакционную среду D-фенилаланина или L-тирозина уровень активности ФАЛ 

инфицированных каллусов значительно ниже, чем при использовании  в качестве субстрата 

L-фенилаланина (рис. 2). Так, в присутствии L-тирозина активность ФАЛ инфицированных 

каллусов составляла 5,3 (∆E/мг белка), при наличии в реакционной среде D-фенилаланина – 

3,1 (∆E/ мг белка), что, соответственно, в 2,8  и 4,9 раза ниже, чем при использовании в качес-

тве субстрата L-фенилаланина. С учетом этого, в дальнейших исследованиях использовали 

лишь L-фенилаланин.

Изучение  влияния  на  активность  ФАЛ  каллусов  сахарной  свеклы,  инфицированных  



A. laidlawii var.granulum шт.118, различных значений рН реакционной смеси показало, что 

максимально высокая активность данного фермента наблюдалась при рН 8,4-8,8 (Рис.3). Тем-

пературный оптимум ферментативной реакции находился в интервале 38-40 

0

С (рис. 4). 



Поскольку данные о влиянии фитопатогенных молликутов на активность ферментов по-

раженных ими растений являются недостаточными, то в нашу задачу входило изучить зави-

симость активности ФАЛ каллусов сахарной свеклы от продолжительности инфицирования 

их A. laidlawii var.granulum шт.118. В связи с этим, уровень активности фермента определяли 

через каждый час после инфицирования патогеном на протяжении 6 ч, а затем через 12, 24, 

48, 60 ч с момента инокуляции каллусной культуры ахолеплазмой  (рис. 5).



83

ISSN 0201-8462. ̳êðîá³îë. æóðí., 2012, Ò. 74, ¹ 5

0

 



2

 

4



 

6

 



8

 

10



 

12

 



14

 

16



 

1

2



3

/



 

 

 



 

 

 



 

Рис. 2. Зависимость активности ФАЛ каллусов сахарной свеклы, инфицированных 

клетками ахолеплазмы, от различных видов субстрата; 1 - L-фенилаланин; 

2 -  D-фенилаланин; 3 - L-тирозин.

0

2



4

6

8



10

12

14



16

18

20



6

7

8



9

10

,



 

/

 



 

 

Рис. 3. Зависимость активности ФАЛ инфицированных ахолеплазмой каллусов 



сахарной свеклы от рН.   

0

5



10

15

20



25

30

20 



25 

30

35



40

45 


t,  

0

 



 

,

 



/

 

     



   

Рис. 4. Зависимость активности ФАЛ инфицированных ахолеплазмой каллусов 

сахарной свеклы от температуры.

0

 



2

 

4



 

6

 



8

 

10



 

12

 



14

 

16



 

18

 



0,5 1  2

6

12



24

48 60 


,

 

/



 

Рис. 5. Динамика активности ФАЛ в каллусах сахарной свеклы при инфицировании 

их A. laidlawii var. granulum шт 118. 

ISSN 0201-8462. ̳êðîá³îë. æóðí., 2012, Ò. 74, ¹ 5

84

Установлено, что активность ФАЛ каллусной культуры сахарной свеклы под воздействи-

ем молликута начинала возрастать уже через 1 ч после инфицирования, через 2 ч уровень ее 

увеличился в 4 раза по сравнению с контролем. При дальнейшем культивировании каллусов 

в присутствии патогена  активность ФАЛ снижалась и через 6 ч культивирования лишь на 

50 % превышал  уровень  активности    неинфицированных  образцов.  Через 24 ч  активность 

ФАЛ снижалась практически до начального уровня и оставалась неизменной в течение всего 

периода изучения (60 ч).

Таким  образом,  установлено,  что  при  заражении  каллусной  культуры  сахарной  свеклы 

фитопатогенным молликутом A. laidlawii var.granulum шт.118 в оптимальных условиях про-

исходит возрастание активности ФАЛ, которое достигает максимального значения в первые 

2 часа после инфицирования.

Изучение фенилаланин-аммиак-лиазной активности в ферментных экстрактах из каллу-

сов сахарной свеклы, инфицированных A. laidlawii var.granulum шт.118, показало, что такие 

характеристики исследуемого фермента как чувствительность к рН, температуре, субстрату 

согласуются с приведенными в литературе [1,3,8]. 

Динамика активности ФАЛ каллусных культур сахарной свеклы  при инфицировании их 

A. laidlawii var.granulum шт.118 и, особенно, значительное увеличение ее активности в пер-

вые часы инокуляции, дает основание полагать, что в исследуемой культуре стимулируются 

защитные реакции в ответ на действие патогена. Известно, что при биотическом стрессе в 

тканях растений в результате изменения активности ФАЛ синтезируются и накапливаются 

фенольные соединения, которые повышают уровень сопротивляемости патогенным организ-

мам [1,2,5,6]. При повреждениях и болезнях в растительных клетках активируется полифе-

нолоксидаза, которая окисляет фенолы до высокотоксичных хинонов, убивающих инфициро-

ванные клетки. При этом инактивируются чужеродные экзоферменты и активируется синтез 

лигнина, откладывающегося в клеточных стенках пораженного растения и препятствующего 

проникновению и дальнейшему распространению патогена [1,11].

Следует  отметить,  что  ранний  пик  активности  ФАЛ  отмечали  и  другие  исследователи, 

например, у растений пшеницы [3,6,12].  Так, было показано, что обработка молодых листков 

пшеницы биопрепаратами, полученными из хвои и древесины различных видов хвойных де-

ревьев, приводит к кратковременному повышению активности ФАЛ и пероксидазы – фермен-

тов, причастных к развитию защитных реакций растений [3]. Имеются данные относительно 

изменения  активности  ФАЛ  растений  под  воздействием  биогенных  элиситоров – хитозана 

и  салициловой  кислоты,  иммуносупрессора – ламинарина,  а  также  некоторых  бактерий 

[2,3,5-7].

Существует  мнение,  что  по  уровню  активности  фенилаланин-аммиак-лиазы  раститель-

ных клеток в ответ на воздействие возбудителей можно судить об устойчивости растения в 

целом к вызываемому им заболеванию [5,11]. Однако, в исследованиях Герасимовой с соавт. 

[2] отсутствие угнетения ламинарином синтеза ФАЛ в тканях клубней картофеля позволило 

авторам поставить под сомнение возможность использования данного фермента в качестве 

критерия индуцированной устойчивости.

Индукция защитных реакций была продемонстрирована также на каллусных культурах 

женьшеня  при  взаимодействии  их  с  патогенным  для  человека  микроорганизмом Yersinia 



pseudotuberculosis. [9]. В ходе исследований относительно влияния этих бактерий на разные 

линии клеточных культур женьшеня Персияновой с соавт. [9] было показано, что уже в те-

чение первых суток культивирования Y. pseudotuberculosis индуцировали экспрессию защит-

ных генов женьшеня, а именно, генов ФАЛ (Pg PAL1, Pg PAL2, Pg PAL3) и β-1,3-глюкана - 

Pg-glu1. При этом, в сравнении с контролем, экспрессия возрастала в 2-4 раза, повышение 

сохранялось и на третьи сутки воздействия иерсиний на каллусы. В наших же исследованиях 

повышение активности ФАЛ носило временный характер (до 24 ч). Вероятно, в ходе жиз-

недеятельности ахолеплазмы способны преодолевать защитные реакции клеток растения и 

избегать реакции сверхчувствительности, что, по всей видимости, и приводит к длительной 

персистенции фитопатогенных молликутов.

Таким образом, на модели паразит-хозяин в условиях in vitro впервые установлено непро-

должительное повышение активности ФАЛ растительных клеток в ответ на проникновение 

фитопатогенной ахолеплазмы, что свидетельствует, с одной стороны, о включении растением 


85

ISSN 0201-8462. ̳êðîá³îë. æóðí., 2012, Ò. 74, ¹ 5

защитных реакций, и, с другой стороны, – вероятно, о способности молликутов преодолевать 

такие механизмы и переходить к персистирующему способу существования. 

Л.П. Панченко, К.С. Коробкова 

Інститут мікробіології і вірусологіі ім. Д.К.Заболотного НАН України, Київ

АКТИВНІСТЬ  ФЕНІЛАЛАНІН-АМІАК-ЛІАЗИ У КАЛЮСНИХ 

КУЛЬТУРАХ ЦУКРОВИХ БУРЯКІВ, ІНФІКОВАНИХ АХОЛЕПЛАЗМОЮ

Р е з ю м е

Вивчали  вплив  Acholeplasma laidlawii var. granulum  шт.118  на  активність  фенілаланін-аміак-ліази 

(ФАЛ,  КФ 4.3.1.5) у  калюсах  цукрових  буряків.  Оптимальними  умовами  проведення  ферментатив-

ної  реакції  були:  використання  як  субстрата L-фенілаланіну,  рН 8.4-8.8, температурний  оптимум 38-

40

о



С. Встановлено, що при зараженні калюсної культури цукрового буряку фітопатогенним молікутом 

відбувається  тимчасове  зростання  активності  ФАЛ,  яке  через 2 год  після  інфікування  досягає 

максимального значення и, поступово знижуючись, через 24 год досягає початкового рівня. Збільшення 

активності ФАЛ рослини розглядають як захисну реакцію у відповідь на дію патогена.



Ключові слова: фенілаланін-аміак-ліаза, калюси, стрес, Acholeplasma laidlawii, молікути.

L.P. Panchenko, K.S. Korobkova 

Zabolotny Institute of Microbiology and Viriology, National Academy of Sience of Ukraine, Kyiv

ACTIVITY OF PHENYLALANINE-AMMONIA-LYASE IN CALLUS 

CULTURES OF SUGAR BEAT INFECTED BY ACHOLEPLASMA 

S u m m a r y

The effect of Acholeplasma laidlawii var. granulum 118 on activity of phenylanine- ammonia-lyase (PAL) 

in callus cultures of sugar beat was researched. The optimal conditions of enzyme reaction were: using the 

L-phenilalanine as a substrate, pH 8.4-8.8, the temperature optimum 38-40

C. It was established that at the 



infecting of sugar beat callus culture by phytopathogenic mollicute the PAL activity was temporarily increased 

and reached its maximum after 2 h of infecting. Then it gradually decreased and in 24 h reached its initial level. 

An increase of PAL activity of plant is considered as protective reaction in response to the action of pathogen.  

The paper is presented in Russian.

K e y   w o r d s: phenylanine-ammonia-lyase, calluses, stress, Acholeplasma laidlawii, mollicutes. 

T h e   a u t h o r ’ s   a d d r e s s:  Panchenko L.P., Zabolotny Institute of Microbiology and Virology, National 

Academy of Siences of Ukraine; 154 Acad. Zabolotny St., Kyiv, MSP, D 03680, Ukraine.

Адамовская  В.Г.,  Молодченкова  В.Г.,  Цигельская  Л.И.,  Безкровная  Л.Я.

1. 

  Изменение  активности 

фенилаланин-аммиак-лиазы, суммарного содержания фенольных соединений и лигнина в проростках 

ярового ячменя при действии фузариозной инфекции // Вісник Харківського Національного аграрн. 

у-ту. Серія біологія. – 2007. – вип.1(10). – С.50–58.

Герасимова  И.Г.,  Придворова  С.М.,  Озерецковская  О.Л.

2. 

  Участие  фенилаланин-аммиак-лиазы  в 

индуцированной устойчивости и восприимчивости картофеля // Прикл. биохим. и микробиол. – 2005. 

 41, №1. – С.117120. 

Евтушенко  Е.В.,  Сапрыкин  В.А.,  Галицын  М.Ю.,  Чекуров  В.М.

3. 

  Влияние  биологически  активных 

веществ из хвойных на активность L-фенилаланин-аммоний-лиазы и пероксидазы в листьях пшеницы 

// Прикл. биохимия и микробиология. – 2008. – 44, № 1. – С. 123–128.



Коробкова К.С., Онищенко А.М., Панченко Л.П., Мамчур О.Є., Дмитрук О.О., Редько

4. 

 

В.І. Створення 

модельної  системи in vitro для  вивчення  взаємодії  фітопатогенних  молікутів  з  клітинами  рослин 

микоплазм // Микробіол. журн. – 2009. – 71, № 4. – С. 58–62.

Озерецковская О.А.

5. 

 Индуцирование устойчивости растений биогенными элиситорами фитопатогенов 

// Микология и фитопатология.  2004. – 30. – С.325339.


ISSN 0201-8462. ̳êðîá³îë. æóðí., 2012, Ò. 74, ¹ 5

86

Олениченко Н.А., Загоскина Р.В.

6. 

 Ответная реакция озимой пшеницы на действие низких температур: 

образование фенольных соединений и активность L-фенилаланин-аммиак-лиазы // Прикл. биохим. и 

микробиол. – 2005  41, №6. – С.681685.



Паду  Э.

7. 

Х.Свойства  пероксидазы  и  фенилаланин-аммиак-лиазы  при  образовании  и  лигнификации 

клеточных стенок стебля пшеницы // Физиология растений. – 1995. 42, №3. – С.408415.

Панина Я.С., Герасимова Н.Г., Чаленко Г.И. и др.

8. 

 Салициловая кислота и фенилаланин-аммиак-лиаза 

в картофеле, инфицированном возбудителем фитофтороза //Физиология растений. – 2005. – 52, №4. 

– С.573–577.



Персиянова Е.В., Киселев К.В., Булгаков В.П., Тимченко Н.Ф., Чернодед Г.К., Журавлев Ю.Н.

9. 

 Индук-


ция защитных реакций в каллусных культурах женьшеня при взаимодействии с патогеном человека 

Yersinia pseudotuberculosis // Физиология растений. – 2008. – 55, № 6. – С.554562

 Скрипаль И. Г., Малиновская Л. П.

10. 

 Среда СМ ИМВ-72 для выделения и культивирования фитопа-

тогенных микоплазм // Микробиол. журн. – 1984. – 46, №2. – С.7175.

  Тютерев  С.Я.

11. 

  Научные  основы  индуцированной  болезне-устойчивости  растений. // С.-Петербург: 

Изд-во ВИЗР. –- 2002. –- С.167-175.

 Яруллина Л.Г., Ибрагимов Р.И.

12. 

 Активность фенилаланин-аммиак-лиазы и ингибиторов протеолити-

ческих ферментов в проростках пшеницы при септориозе // Физиология и биохимия культур расте-

ний. – 2000. – 32, №3. – С.223229.



 Bradford M.M

13. 

. A rapid and sensitive method for quantitation of microgram quantities of protein utilizing the 

principle of protein-dye binding // Anal. Biochem. – 1976. – 71, № 2. – P. 248254.

 Gamborg O.G., Eveleigh D.E.

14. 

Culture methoda and detection of glucanases in cultures of wheat and barley 

// Canad.J.Biochem.  1968. – 46, N5.  P.417421.

 Zucker M

15. 

. Induction of phenylalanine deaminase by light and its relation to chlorogenic acid synthesis in 



potato tubsar tissue // Plant Physiol.  1965. – 40 779784.

Отримано 17.05.2011





Достарыңызбен бөлісу:


©stom.tilimen.org 2019
әкімшілігінің қараңыз

    Басты бет